化學(xué)發(fā)光法的原理技術(shù)要點(diǎn)及評(píng)價(jià)應(yīng)用課件

化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)第一節(jié)發(fā)光與化學(xué)發(fā)光劑第二節(jié)發(fā)光酶免疫測(cè)定（CLEIA）（chemiluminescenceenzymeimmunoasssay）

第三節(jié)化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)(CLIA)（chemiluminescenceimmunoassay）

第四章電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)(ECLI)(electrochemiluminescenceimmunoassay)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)第一節(jié)發(fā)光與化學(xué)發(fā)光劑1化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)：集靈敏的化學(xué)發(fā)光分析和特異的抗原抗體免疫測(cè)定于一體的檢測(cè)技術(shù)。概念特點(diǎn)：特異性高、敏感性高、分離簡(jiǎn)便、快速、試劑無毒、安全穩(wěn)定、可自動(dòng)化。化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)：集靈敏的化學(xué)概念特點(diǎn)：2化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的類型按發(fā)光劑不同分為1.發(fā)光酶免疫測(cè)定（CLEIA）chemiluminescenceenzymeimmunoasssay

2.化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)(CLIA)chemiluminescenceimmunoassay

3.電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)(ECLI)electrochemiluminescenceimmunoassay按分離方法不同分

1.微粒子化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定

2.磁顆粒化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的類型按發(fā)光劑不同分為3第一節(jié)發(fā)光與化學(xué)發(fā)光劑一、發(fā)光一種物質(zhì)由電子激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時(shí)，釋放出的能量表現(xiàn)為光的發(fā)射。1.光照發(fā)光:發(fā)光劑經(jīng)短波長入射光照射后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)回復(fù)至基態(tài)時(shí)發(fā)出較長波長的可見光。2.生物發(fā)光:反應(yīng)底物在熒光素酶的催化下利用ATP產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)的氧化熒光素，后者在回復(fù)到基態(tài)時(shí)多余的能量以光子形式放出。3.化學(xué)發(fā)光:在常溫下由化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的光的發(fā)射?；瘜W(xué)發(fā)光是一個(gè)多步驟的過程。第一節(jié)發(fā)光與化學(xué)發(fā)光劑一、發(fā)光一種物質(zhì)由電子激發(fā)態(tài)回4

熒光素酶ATP；O2；Mg2+氧化螢火蟲熒光素螢火蟲熒光素生物發(fā)光返回光+AMP+O2+CO2+熒光素酶氧化螢火蟲熒光素螢火蟲熒光素生物發(fā)光返回光5化學(xué)發(fā)光

機(jī)制：某些化合物可以利用化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的能量使其產(chǎn)物分子或反應(yīng)中間態(tài)分子上升至電子激發(fā)態(tài)。當(dāng)此產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子衰退至基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光子的形式釋放能量（即發(fā)光）。二、化學(xué)發(fā)光劑化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物：在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物。發(fā)光劑分為熒光素、生物發(fā)光劑、化學(xué)發(fā)光劑化學(xué)發(fā)光機(jī)制：某些化合物可以利用化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的能二、化學(xué)6①能參與化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；②與抗原或抗體偶聯(lián)后形成穩(wěn)定的結(jié)合物試劑；③偶聯(lián)后仍保留高的量子效應(yīng)和反應(yīng)動(dòng)力；④應(yīng)不改變或極少改變被標(biāo)記物的理化特性，特別是免疫活性?；瘜W(xué)發(fā)光劑應(yīng)符合以下幾個(gè)條件返回①能參與化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；化學(xué)發(fā)光劑應(yīng)符合以下幾個(gè)條件返回71.酶促反應(yīng)的發(fā)光底物是指經(jīng)酶的降解作用而發(fā)出光的一類發(fā)光底物。CLEIA中常用的酶有HRP和APHRP的發(fā)光底物有魯米諾、對(duì)-羥基苯乙酸AP的發(fā)光底物有AMPPD、4-MUP（熒光底物）特點(diǎn)：可作標(biāo)記物、也可作過氧化物酶的底物1.1魯米諾H2O2/OH—HRP+N2+H2O

+光1.酶促反應(yīng)的發(fā)光底物是指經(jīng)酶的降解作用而發(fā)出光的一類發(fā)光8對(duì)-羥基苯乙酸（HPA）HPA在H2O2存在下被HRP氧化成氧化二聚體（熒光物質(zhì)），在350nm激發(fā)光作用下，發(fā)出450nm波長的熒光，可用熒光光度計(jì)測(cè)量。1.2HPAH2O2HRP+熒光氧化二聚體對(duì)-羥基苯乙酸（HPA）HPA在H2O2存在下被HRP氧化9AMPPDAMPPD在堿性條件下，被AP酶解生成相當(dāng)穩(wěn)定的AMP-D陰離子，其有2～30min的分解半衰期，發(fā)出波長為470nm的持續(xù)性光，在15min時(shí)其強(qiáng)度達(dá)到高峰，15～60min內(nèi)光強(qiáng)度保持相對(duì)穩(wěn)定。光AP

/OH—HPO42—1.3AMPPDAMPPDAMPPD在堿性條件下，被AP酶解生成相當(dāng)穩(wěn)定的104-MUP4-MUP被AP催化生成4-甲基傘形酮，在360nm的激發(fā)光的作用下，發(fā)出448nm的熒光，可用熒光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。熒光AP1.44-MUP4-MU360nm激發(fā)光H3PO4+4-MUP4-MUP被AP催化生成4-甲基傘形酮，在360112.直接化學(xué)發(fā)光劑特點(diǎn)：不需催化劑，只需改變?nèi)芤旱膒H等條件就能發(fā)光的物質(zhì)。反應(yīng)迅速、背景低、信比高，發(fā)光量與AE濃度呈線性關(guān)系。常用試劑：吖啶酯（acridinium，AE）+CO2+光2.直接化學(xué)發(fā)光劑特點(diǎn)：不需催化劑，只需改變?nèi)芤旱膒H等條件123.電化學(xué)發(fā)光劑是指通過在電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)出光的物質(zhì)。特點(diǎn)：①反應(yīng)在電極進(jìn)行；②電子供體為：三丙胺（TPA）③化學(xué)發(fā)光劑：三聯(lián)毗啶釕返回三聯(lián)毗啶釕分子結(jié)構(gòu)圖3.電化學(xué)發(fā)光劑是指通過在電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)出返回13第二節(jié)發(fā)光酶免疫測(cè)定（CLEIA）一、原理屬于酶免疫測(cè)定的一種。只是最后一步酶反應(yīng)所用底物為發(fā)光劑，通過發(fā)光反應(yīng)發(fā)出的光在特定的儀器上進(jìn)行測(cè)定。二、技術(shù)類型

根據(jù)酶促反應(yīng)底物不同可分為：1.熒光酶免疫測(cè)定技術(shù)

2.化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定技術(shù)根據(jù)免疫學(xué)反應(yīng)模式分

1.雙抗體夾心法和雙抗原夾心法3.固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法：第二節(jié)發(fā)光酶免疫測(cè)定（CLEIA）一、原理屬于酶免疫14熒光酶免疫測(cè)定技術(shù)反應(yīng)原理圖洗滌棄上清是利用理想的酶熒光底物，生成的產(chǎn)物穩(wěn)定并有強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，通過測(cè)定熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量。熒光酶免疫測(cè)定技術(shù)反應(yīng)原理圖洗滌是利用理想的酶熒光底物，15化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定技術(shù)反應(yīng)原理圖洗滌棄上清是利用酶對(duì)發(fā)光底物催化作用而直接發(fā)光，通過光強(qiáng)度的測(cè)定而直接進(jìn)行定量。化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定技術(shù)反應(yīng)原理圖洗滌是利用酶對(duì)發(fā)光底16電化學(xué)發(fā)光原理圖這一過程可在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行產(chǎn)生許多光子，使光信號(hào)增強(qiáng)

返回激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定基態(tài)電極電化學(xué)發(fā)光原理圖這一過程可在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行返回激發(fā)171.抗原抗體結(jié)合反應(yīng)將已包被了抗體的乳膠微粒和待測(cè)標(biāo)本加入反應(yīng)杯中，經(jīng)溫育一定時(shí)間后,再加入AP標(biāo)記抗體，溫育,形成固相包被抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物技術(shù)要點(diǎn)2.分離技術(shù)將復(fù)合物轉(zhuǎn)移到玻璃纖維上，用緩沖液洗滌，沒結(jié)合的抗原被洗脫，酶標(biāo)抗體-抗原-膠乳微?？贵w復(fù)合物則被保留在纖維膜上。3.酶促發(fā)光反應(yīng)

加入4-MUP，酶標(biāo)抗體上AP將4-MUP分解，形成4-MU，它在360nm激發(fā)光的照射下，發(fā)出448nm的熒光，經(jīng)熒光儀記錄，放大，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線由電腦計(jì)算出所測(cè)物質(zhì)的含量1.抗原抗體結(jié)合反應(yīng)將已包被了抗體的乳膠微技術(shù)要點(diǎn)2.181.磁顆粒分離法：用抗原或抗體包被磁顆粒,與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體和酶標(biāo)的抗體或抗原通過一定模式的免疫學(xué)反應(yīng)后,最終通過磁場(chǎng)將結(jié)合酶標(biāo)記物IC和游離酶標(biāo)記物進(jìn)行分離的技術(shù)。分離技術(shù)2.微粒子捕獲法：所用顆粒是無磁性微粒子作為抗體或抗原的包被載體,然后用纖維膜柱子進(jìn)行酶標(biāo)記物的結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的分離。3.包被珠分離法：用聚苯乙稀等材料制成小珠,在小珠上包被抗原或抗體,經(jīng)抗原抗體反應(yīng)后,將結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的酶標(biāo)記物進(jìn)行分離.1.磁顆粒分離法：用抗原或抗體包被磁顆粒,與標(biāo)分離技術(shù)2.微19第三節(jié)化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)（CLIA）一、原理用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體,與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)Ab或Ag、磁顆粒性的Ag或Ab反應(yīng)，通過磁場(chǎng)把結(jié)合狀態(tài)（沉淀部分）和游離狀態(tài)的化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)記物分離開來，然后加入發(fā)光促進(jìn)劑進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，通過對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的檢測(cè)進(jìn)行定量或定性檢測(cè)。二、技術(shù)類型

1.分離方法常用磁顆粒分離技術(shù)2.免疫學(xué)反應(yīng)模式同酶發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)3.不同只是相應(yīng)標(biāo)記物是吖啶酯而不是酶第三節(jié)化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)（CLIA）一、原理用化學(xué)201.抗原抗體結(jié)合反應(yīng)將包被McAb的磁顆粒和待測(cè)標(biāo)本加入到反應(yīng)管中，標(biāo)本中待測(cè)Ag與磁珠上Ab結(jié)合，再加上AE標(biāo)記Ab，經(jīng)過溫育，形成磁珠Ab-Ag-AE標(biāo)記Ab復(fù)合物。技術(shù)要點(diǎn)2.分離技術(shù)在電磁場(chǎng)中進(jìn)行2-3次洗滌后，很快地將未結(jié)合的多余Ag和標(biāo)記Ab洗去。3.化學(xué)發(fā)光反應(yīng)經(jīng)洗滌的磁珠中，加入H2O2和pH糾正液NaOH，這時(shí)AE不需要催化劑即分解并發(fā)光，由集光器接收，經(jīng)光電倍增管放大，記錄1S內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，其積分與被測(cè)物含量成正比，按標(biāo)準(zhǔn)曲線，儀器可計(jì)算出被測(cè)物含量。1.抗原抗體結(jié)合反應(yīng)將包被McAb的磁顆粒和待技術(shù)要點(diǎn)211.AE其低背景噪音、化學(xué)反應(yīng)簡(jiǎn)單、快速而無催化劑。方法評(píng)價(jià)2.AE與大分子的結(jié)合并無減少所產(chǎn)生的光量，從而增加靈敏度，靈敏度可達(dá)10-15g/ml。3.AE標(biāo)記試劑有效期長，可達(dá)一年。4.固相分離劑為極為幼細(xì)的磁粉，除增大包被面積，加快反應(yīng)外，亦同時(shí)使清洗及分離更簡(jiǎn)易、快捷。1.AE其低背景噪音、化學(xué)反應(yīng)簡(jiǎn)單、快速而無催方法評(píng)價(jià)222第四節(jié)電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)（ECLI）一、原理是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，實(shí)際上包括了電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光二個(gè)過程。ECL是電啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng)，而CL是通過化合物混合啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng)。用化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+標(biāo)記Ab，通過Ag-Ab反應(yīng)和磁珠分離技術(shù)，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強(qiáng)度對(duì)待測(cè)的Ag或Ab進(jìn)行定量/定性。二、技術(shù)類型

1.分離方法常用磁顆粒分離技術(shù)2.免疫學(xué)反應(yīng)模式同酶發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)3.相應(yīng)標(biāo)記物是三聯(lián)吡啶釕而不是酶第四節(jié)電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)（ECLI）一、原理是一231.三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體和生物素標(biāo)記抗體與待測(cè)標(biāo)本同時(shí)加入一個(gè)反應(yīng)杯中孵育反應(yīng)技術(shù)要點(diǎn)2.將鏈霉親和素（SA）包被磁珠加入反應(yīng)杯中，再次孵育，使生物素（B）通過與親和素（A）的結(jié)合，將磁珠、Ab連接為一體，形成雙Ab夾心法。3.蠕動(dòng)泵將形成的[Ru(bpy)3]2+-Ab-Ag-Ab-B-SA-磁珠復(fù)合體吸入流動(dòng)測(cè)量室，磁珠被工作電極下面的磁鐵吸附于電極表面。同時(shí)，游離的Ab也被吸出測(cè)量室。4.蠕動(dòng)泵加入TPA，電極加電壓，啟動(dòng)ECL反應(yīng)過程。該過程在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行，產(chǎn)生許多光子，光電倍增管檢測(cè)光強(qiáng)度，其與[Ru(bpy)3]2+的濃度呈線性關(guān)系,故可測(cè)出待測(cè)Ag的含量。1.三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體和生物素標(biāo)記抗體與待測(cè)標(biāo)本技術(shù)要點(diǎn)24原理圖返回抗體包被樣本Ru(byp)2+TPA緩沖的磁珠抗原標(biāo)記抗體液洗滌3原理圖返回抗體包被樣本Ru(byp)225方法評(píng)價(jià)①標(biāo)記物的再循環(huán)利用，使發(fā)光時(shí)間更長、強(qiáng)度更高、易于測(cè)定；②敏感度高，可達(dá)pg／ml