AHI基因啟動子的克隆及轉(zhuǎn)錄活性的鑒定課件

研究背景Joubert綜合征常染色體遺傳病臨床表現(xiàn)：小腦共濟失調(diào)，雙眼運動不能，肌張力減弱；病因：發(fā)育過程中小腦齒狀核和皮質(zhì)脊髓束的神經(jīng)元軸突不能穿越中線形成神經(jīng)交叉。研究背景Joubert綜合1

立論依據(jù)動物實驗：小鼠同源基因Ahi1在小腦齒狀核和深部第五層皮層神經(jīng)元中高表達，齒狀核神經(jīng)元軸突穿越中線，參與形成小腦上腳；而深部皮層神經(jīng)元的軸突形成皮質(zhì)脊髓束．當Ahi1基因發(fā)生突變，小腦齒狀核神經(jīng)元和深部皮層神經(jīng)元的軸突則不能穿越中線，表現(xiàn)出Joubert綜合征；研究表明：Joubert綜合征家系的患者有AHI1基因的移碼突變和錯義突變；結(jié)論：AHI1基因在皮質(zhì)脊髓束和小腦齒狀核神經(jīng)元穿越中線的過程中發(fā)揮著重要作用。立論依據(jù)動物實驗：小鼠同源基2AHI1基因基因結(jié)構(gòu)：6q23.2，含有28個外顯子表達部位：成年人小腦和大腦皮質(zhì)中高表達當前進展：至今AHI1基因的表達調(diào)控機制尚不清楚.．研究內(nèi)容：本課題擬通過研究AHI1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，以揭示Joubert綜合征的發(fā)生機理和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中神經(jīng)元穿越中線的分子機制．AHI1基因3

研究方法利用生物信息學軟件預測分析轉(zhuǎn)錄調(diào)控信息利用基因工程方法驗證不同長度AHI15’端側(cè)翼序列是否具有啟動調(diào)控活性在生物信息學基礎上，以EMSA法分析與之結(jié)合的因子將已克隆入pEGFP-1的AHI1轉(zhuǎn)錄活性序列及與之結(jié)合的調(diào)節(jié)因子ORF的重組子共轉(zhuǎn)染細胞，通過分析熒光蛋白活性分析反式作用因子對AHI1轉(zhuǎn)錄的影響研究方法利用生物信息學軟件預4

技術路線㈠預測AHI1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控信息①在Genbank中找到AHI1的基因組序列(No.NT_025741)②利用Promoter2.0,Genescan等軟件分析AHI1基因序列，預測啟動子的位置．③用CapsiteHunting法確定轉(zhuǎn)錄起始位點．技術路線㈠預測AHI1基因的5㈡重組克隆不同長度的5’端側(cè)翼序列①根據(jù)預測的啟動子位置設計上游下游引物。②通過PCR擴增含有啟動子的不同長度5’端側(cè)翼序列。③以pEGFP-1質(zhì)粒為載體，重組克隆不同長度5’端側(cè)翼序列．AHI基因啟動子的克隆及轉(zhuǎn)錄活性的鑒定ppt課件6

㈢轉(zhuǎn)染真核細胞cos-7，通過分析綠色熒光蛋白表達的有無和亮度確定具有轉(zhuǎn)錄活性的序列．

5‘端側(cè)翼序列①陰性對照組：

pEGFP-1②陽性對照組：pEGFP-N1③實驗組：

AHI1-pEGFP-1

㈢轉(zhuǎn)染真核細胞cos-7，通過分析綠色熒光蛋白表達的有無7㈣通過生物信息學分析能與具有轉(zhuǎn)錄活性的序列相結(jié)合的調(diào)節(jié)因子，以EMSA法驗證．

EMSA(ElectrophoreticMobilityShiftAssay,

電泳遷移率實驗)㈣通過生物信息學分析能與具有轉(zhuǎn)錄活性的序列相結(jié)合的調(diào)節(jié)因子，8㈤將分別含有調(diào)節(jié)因子ORF和調(diào)控活性序列的重組子共轉(zhuǎn)染cos-7，通過分析綠色熒光蛋白表達的有無和亮度，分析調(diào)節(jié)因子對AHI1基因轉(zhuǎn)錄的影響．

實驗設計：①對照組：含AHI1啟動子序列的重組pEGFP-1轉(zhuǎn)染COS-7②實驗組：

AHI1啟動子序列的重組pEGFP-1

編碼調(diào)節(jié)因子ORF的重組子共轉(zhuǎn)染COS－7㈤將分別含有調(diào)節(jié)因子ORF和調(diào)控活性序列的重組子共轉(zhuǎn)染cos9

預期結(jié)果⒈確定AHI1轉(zhuǎn)錄起始位點⒉克隆出AHI1