抗原的表達(dá)和純化

抗原的表達(dá)和純化第1頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、抗原組生產(chǎn)流程Ag組的操作流程菌種接種培養(yǎng)過夜擴(kuò)大培養(yǎng)誘導(dǎo)繼續(xù)培養(yǎng)收集菌體破碎菌體離心沉淀包涵體純化步驟可溶性蛋白純化步驟上清第2頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月可溶蛋白具體生產(chǎn)步驟1、接種80ul菌種至100ml抗性培養(yǎng)基中，37度培養(yǎng)過夜。2、次日加入新鮮抗性培養(yǎng)基至600ml，培養(yǎng)1.5小時(shí)至活力最旺盛。3、加入0.5mM的IPTG誘導(dǎo)3.5小時(shí)4、收集菌體（66轉(zhuǎn)/秒×15min),棄上清，加入PBST懸浮菌體，加入200ulMPMSF,100ulEDTA(his標(biāo)簽蛋白不加），冰浴下超聲破碎細(xì)胞。5、搖床4度孵育1小時(shí)。6、高速離心，133轉(zhuǎn)/秒×15min。取上清，加入600ulbeads結(jié)合過夜。7、收集beads（33轉(zhuǎn)/秒、瞬時(shí)），洗滌液洗滌3次。加入300ul洗脫液，4℃振蕩洗脫1小時(shí)，瞬時(shí)離心，取上清。再次加入300ul洗脫液，洗脫1小時(shí)，兩次洗脫液合為一管。8、將所得的上清取10ul加入10ulsamplebuffer制樣，SDS跑膠。9、根據(jù)maker的跑膠結(jié)果目測(cè)蛋白質(zhì)量及濃度。第3頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、實(shí)驗(yàn)原理基因的表達(dá)親和層析純化可溶蛋白包涵體的純化原理SDS－PAGE電泳的基本原理第4頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、基因的表達(dá)在特定環(huán)境信號(hào)刺激下，相應(yīng)的基因被激活，基因表達(dá)產(chǎn)物增加，這種基因稱為可誘導(dǎo)基因。可誘導(dǎo)基因在特定環(huán)境中表達(dá)增強(qiáng)的過程，稱為誘導(dǎo)。如果基因?qū)Νh(huán)境信號(hào)應(yīng)答是被抑制，這種基因是可阻遏基因?？勺瓒艋虮磉_(dá)產(chǎn)物水平降低的過程稱為阻遏

。原核生物的基因調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上。原核生物的基因表達(dá)主要是負(fù)性調(diào)控，誘導(dǎo)物可用于去除阻遏作用。公司構(gòu)建的基因工程菌采用乳糖操縱子調(diào)控系統(tǒng)。第5頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（一）乳糖操縱子(lacoperon)的結(jié)構(gòu)調(diào)控區(qū)CAP結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)序列操縱序列調(diào)節(jié)基因ZYAOPDNAI結(jié)構(gòu)基因Z：β-半乳糖苷酶Y：透性酶A：乙?；D(zhuǎn)移酶第6頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)mRNA阻遏蛋白阻遏基因IDNAZYAOP沒有乳糖存在時(shí)pol第7頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月有乳糖存在時(shí)IDNAZYAOPpol啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄mRNA阻遏蛋白mRNA乳糖別乳糖β-半乳糖苷酶第8頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（三）CAP/CRP的正性調(diào)節(jié)CAP(cataboliteactivatorprotein,分解代謝物激活蛋白)涉及到正性調(diào)節(jié).CAP又稱為CRP(cAMPreceptorprotein),lacoperon高水平轉(zhuǎn)錄必需的一個(gè)激活蛋白。葡萄糖抑制cAMP的形成。葡萄糖存在時(shí)，cAMP濃度低；僅在葡萄糖消耗完畢時(shí),cAMP濃度增高。第9頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月++++轉(zhuǎn)錄無葡萄糖，cAMP濃度高時(shí)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄ZYAOPDNACAPcAMPCAPcAMPCAPcAMPCAP結(jié)合位點(diǎn)第10頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月lacI-系統(tǒng)中，不管是否存在乳糖，三種乳糖分解代謝有關(guān)的酶得到持續(xù)表達(dá)。lacI+系統(tǒng)中，當(dāng)葡萄糖存在時(shí)，不表達(dá)三種酶；然而，當(dāng)存在乳糖而又缺乏葡萄糖時(shí)，這三種酶得到表達(dá)。第11頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月乳糖操縱子受到兩種調(diào)節(jié)：阻遏蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)和CAP的正調(diào)節(jié)，有兩道控制開關(guān)，只有兩道開關(guān)同時(shí)打開時(shí),即只有在缺乏葡萄糖并存在乳糖時(shí),基因才能夠轉(zhuǎn)錄。mRNAZYAOPDNAImRNA阻遏蛋白乳糖別乳糖β-半乳糖苷酶CAPcAMPCAPcAMPpol啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄CAPcAMP第12頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（四）乳糖操縱子誘導(dǎo)物由于乳糖雖可誘導(dǎo)酶的合成，但易被β-半乳糖苷酶催化降解，并且產(chǎn)生很多復(fù)雜的動(dòng)力學(xué)問題，因此人們常用安慰誘導(dǎo)物誘導(dǎo)。乳糖操縱子的安慰誘導(dǎo)物除了異丙基巰基半乳糖（IPTG)，還可以是巰基半乳糖苷（TMG）、O-硝基半乳糖苷（ONPG)。IPTG為常用的誘導(dǎo)物，是一種十分有效的乳糖操縱子的誘導(dǎo)劑,可與阻遏物結(jié)合促進(jìn)基因的表達(dá)。IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被運(yùn)送，不被大腸桿菌所分解所以濃度并不改變第13頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（五）影響蛋白表達(dá)的因素IPTG濃度：0.1-1mM0.5mM誘導(dǎo)溫度:28℃37℃誘導(dǎo)時(shí)間:3.5h第14頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月四、親和層析純化可溶性蛋白目前我們公司生產(chǎn)的抗原絕大部分是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白和6XHISTag融合蛋白。融合蛋白的優(yōu)點(diǎn)有：(1)表達(dá)效率高；(2)產(chǎn)生的融合蛋白比天然蛋白更穩(wěn)定，融合蛋白是避免細(xì)菌蛋白酶降解的最好措施；(3)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)易于鑒定，純化。GST-tag序列可以增加融合蛋白的溶解性。His-tag表達(dá)方便而且基本不影響蛋白的活性第15頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月親和層析是利用待分離物質(zhì)和它的特異性配體間具有特異的親和力，從而達(dá)到分離目的蛋白的一類特殊層析技術(shù)。（一）親和層析技術(shù)原理第16頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月通常兩個(gè)分子間特異親和力的形成有兩種情況：（1）兩個(gè)分子之間，其構(gòu)形有如積木般的互補(bǔ)，因?yàn)榉兜氯A力的關(guān)系，產(chǎn)生特異親和力（2）兩分子之間，因?yàn)槟承┗鶊F(tuán)間產(chǎn)生了二級(jí)鍵，造成了吸引力。親和層析法按親和配基的親和力大小可分為兩類（1）特異性配基親和層析法，其配基，包括生物素、激素、抗原等，KD值為10-7～10-15。

（2）通用性配基親和層析法，其配基包括天然配基、染料、氨基酸或肽、核酸、肝素、螯合金屬離子等，KD值為10-4～10-6。（二）親和層析法分類第17頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月利用了GST與GSH間酶與底物構(gòu)象互補(bǔ)的特異性結(jié)合特性，將帶標(biāo)簽的蛋白與其他蛋白分離開。其結(jié)合力是范德華力，結(jié)合力弱且需較長(zhǎng)的結(jié)合時(shí)間，但特異性高。GSTfusionprotein的洗脫原理是通過調(diào)節(jié)GSH濃度及洗脫時(shí)間將目的蛋白洗脫下來,洗脫液中的還原型GSH與beads上的谷胱甘肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合融合蛋白，從而將目標(biāo)蛋白洗脫。

（三）GSTfusionprotein的純化

——特異性配基親和層析法第18頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月此圖為Glutathionesepharose的終端結(jié)構(gòu)，谷胱甘肽通過SH基團(tuán)與sepharose基質(zhì)的環(huán)氧乙烷基團(tuán)通過環(huán)氧激活特異偶聯(lián)到sepharose上。此圖為凝膠上的手臂谷胱甘肽與GST-tag融合蛋白結(jié)合后結(jié)構(gòu)，中間紅色的部分既為谷胱甘肽。第19頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月GST親和純化中常見的問題1SymptomsPossibleCausesComments結(jié)合在beads上的目的蛋白過少細(xì)胞裂解效果不好延長(zhǎng)破碎時(shí)間，加大破碎率表達(dá)的目的蛋白不溶通過抑制包涵體的形成來增加目的蛋白的可溶性目的蛋白自身的降解細(xì)胞破碎后：加大蛋白酶抑制劑；操作過程保持低溫，動(dòng)作柔和，輕拿輕放。目的蛋白與beads結(jié)合時(shí)，pH值沒調(diào)好GSTfusionprotein與beads的結(jié)合對(duì)pH值是相當(dāng)敏感的pH>8.0對(duì)結(jié)合不利。一般bindingbufferpH=7.4蛋白結(jié)合后過度的洗滌為避免將一些結(jié)合不牢固的目的蛋白洗下來，要限制洗滌次數(shù)第20頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月GST親和純化中常見的問題2SymptomsPossibleCausesComments目的蛋白的洗脫效果不好目的蛋白分子量太大蛋白越大，洗脫效率越低。1.適當(dāng)提高洗脫液中GSH的濃度；2.提高洗脫液的鹽離子濃度（Nacl:100-500mM）；3.調(diào)節(jié)洗脫液的pH值，pH>8.0洗脫效率大于pH=7.4；4.加大洗脫體積，延長(zhǎng)洗脫時(shí)間SDS檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)雜帶多目的蛋白降解可1.使用較溫和的破碎條件；2.保持低溫；3.避免破碎時(shí)蛋白產(chǎn)生氣泡；4.加入還原劑如10mMDTT于裂解液中。雜蛋白的共純化可1.增加洗滌次數(shù)；2.提高bindingbuffer鹽離子濃度（Nacl:500mM），可降低一些因?yàn)殡x子作用帶來的非特異性吸附；3.延長(zhǎng)破碎后蛋白的孵育時(shí)間及133轉(zhuǎn)離心時(shí)間；4.縮短蛋白與beadsbinding時(shí)間第21頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（四）6XHISTag蛋白的純化

——特異性配基親和層析法蛋白質(zhì)表面的一些氨基酸，例如組氨酸等能夠與多種過渡金屬離子如Cu2+，Zn2+，Ni2+發(fā)生特殊的相互作用。因此偶聯(lián)了合適金屬離子的瓊脂糖凝膠就能夠選擇性的吸附那些含有組氨酸的蛋白和對(duì)金屬離子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。beads與6xHisfusionprotein間產(chǎn)生了共價(jià)鍵，結(jié)合力強(qiáng)但特異性差。組氨酸殘基的五元咪唑環(huán)是蛋白與Ni離子作用的關(guān)鍵。第22頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6xHisfusionprotein的洗脫原理是通過高濃度的咪唑洗脫目的蛋白，洗脫液中的咪唑通過和金屬離子結(jié)合而高效地替換掉His標(biāo)簽融合蛋白。由于一些宿主細(xì)胞蛋白上也含有組氨酸，可以結(jié)合在beads上，洗脫時(shí)也會(huì)被洗脫下來（特異性差的原因）。因此在洗滌液中加入低濃度咪唑，可以避免宿主細(xì)胞蛋白的結(jié)合。第23頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月HIS標(biāo)簽蛋白親和純化中常見的問題1SymptomsPossibleCausescomments目的蛋白無法與beads結(jié)合蛋白降解1.加大蛋白酶抑制劑；2.操作過程保持低溫，動(dòng)作柔和，輕拿輕放。bindingbufferpH有錯(cuò)誤調(diào)整pH=7.5蛋白鹽離子濃度太大結(jié)合前，稀釋蛋白溶液目的蛋白His-tag隱藏目的蛋白水溶性差，自身折疊將His-tag包裹隱藏起來?？蓢L試在變性的條件下與beads結(jié)合，確保beads工作良好的前提下，調(diào)整一下beads結(jié)合的pH值；延長(zhǎng)樣品與beads結(jié)合的時(shí)間一些表達(dá)量很大的雜蛋白吸附于beads上，使目的蛋白無法吸附在目的蛋白與beads結(jié)合時(shí)，向蛋白溶液內(nèi)加入20mM咪唑減少非特異性吸附第24頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月HIS標(biāo)簽蛋白親和純化中常見的問題2SymptomsPossibleCausesComments目的蛋白的洗脫效果不好目的蛋白本身帶有一個(gè)金屬離子結(jié)合域加大洗脫液中咪唑濃度SDS檢測(cè)雜帶多宿主菌表達(dá)了一些能與HisTag共同結(jié)合在beads上的雜蛋白原因：1.有些雜蛋白本身帶有His殘基，并暴露在蛋白的表面，2.金屬螯合層析本身的特異性較弱，Ni離子不僅能與His殘基中的咪唑環(huán)結(jié)