原發(fā)性肝癌組織雙向電泳技術(shù)優(yōu)化

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0g/LPMSF蛋白酶抑制劑)，裂解液(7mmol/L尿素、2mol/L硫脲、40g/LCHAPS、100mmol/LDTT、50g/L(pH3～10)IPGbuffer，1mmol/LPMSF)，超聲裂解，15℃，離心10min，取上清液，4℃，超速離心50min，避開漂移的脂質(zhì)層，吸取離心上清4℃，再次離心50min;取上清。Bradford法定量，分裝后置-80℃保存。為充分去除樣本中含有的雜質(zhì)對(duì)等電聚焦的影響，我們采納了常用的三種蛋白沉淀方法，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。①丙酮沉淀蛋白：加入4倍體積的冰丙酮使蛋白在-20℃沉淀至少2h，4℃，離心15min，用裂解液重溶。②三氯乙酸/丙酮沉淀：將三氯乙酸加到提取組織液中，終質(zhì)量濃度為100g/L，再加入4倍體積的冰丙酮使蛋白在-20℃沉淀至少2h，4℃離心15min，最終再用冰丙酮清洗沉淀，去除三氯乙酸，用裂解液重溶。③Cleaning-up試劑盒沉淀蛋白：按Amersham公司的試劑盒說(shuō)明書操作，用裂解液重溶。

1.2.2等電聚焦電泳

分別實(shí)行目前常用兩種上樣方法：標(biāo)準(zhǔn)膠條槽上樣(主動(dòng)水化)及杯上樣(被動(dòng)水化)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較分析。聚焦程序參考聚焦系統(tǒng)操作指南，同時(shí)利用軟件對(duì)聚焦電壓，電流進(jìn)行檢測(cè)，指導(dǎo)聚焦程序的調(diào)整，對(duì)不同聚焦方法進(jìn)行比較分析(表1)。

1.2.3其次向SDS電泳

(SDS)等電聚焦后的膠條分別以SDS平衡緩沖液(第一次加入100mg/10mLDTT，其次次加入250mg/10mL碘乙酰胺)平衡兩次，每次15min。平衡后IPG膠條轉(zhuǎn)移至電泳系統(tǒng)，用125g/L的膠進(jìn)行二向電泳，每塊膠2W，電泳50min后改為每塊膠15W，電泳至溴酚藍(lán)跑到凝膠底部。凝膠進(jìn)行熱考馬斯亮蘭染色。

1.2.4凝膠圖像采集與分析

染色后凝膠以Imagescanner高密度掃描儀獵取圖像，利用ImageMaster軟件對(duì)圖像進(jìn)行蛋白質(zhì)斑點(diǎn)自動(dòng)檢測(cè)，然后手工刪除假點(diǎn)，添加未檢出的斑點(diǎn)，最終進(jìn)行斑點(diǎn)匹配，分析。

2結(jié)果

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2.1蛋白沉淀方法對(duì)電泳結(jié)果的影響

從圖1可見，未經(jīng)處理的樣本蛋白點(diǎn)雖然許多(1920點(diǎn))，但辨別率很差。丙酮，TCA-丙酮，Cleaning-up試劑盒沉淀后的樣本與原始樣本相比均有許多改善，但TCA-丙酮丟失的蛋白較多(1644點(diǎn))，丙酮(1856點(diǎn))，和Cleaning-up(1713點(diǎn))丟失的蛋白較少。圖1B中，經(jīng)TCA-丙酮沉淀后，酸性蛋白大量丟失。圖1C中，丙酮沉淀蛋白點(diǎn)數(shù)多且清晰，無(wú)明顯拖帶和條紋，背景潔凈清楚，說(shuō)明蛋白質(zhì)富集和純化的效果都比較好。

2.2不同聚焦條件對(duì)電泳結(jié)果的影響

圖2中，A聚焦電壓是80kV，B聚焦電壓140kV。由于聚焦時(shí)電流較高，將500V延長(zhǎng)2h，1kV延長(zhǎng)了1h，從圖中可見B的聚焦效果比A有很大改善。圖C是我們監(jiān)測(cè)的延長(zhǎng)低壓聚焦后(圖B)的IEF電壓走勢(shì)圖，從圖中可見電壓升至設(shè)定的80kV進(jìn)行聚焦。圖2B蛋白點(diǎn)數(shù)較A明顯增多，特殊是酸性端，說(shuō)明B聚焦效果明顯好于A。

2.3主動(dòng)水化與被動(dòng)水化上樣的電泳結(jié)果

從圖3中可看出，圖A中的蛋白點(diǎn)數(shù)明顯增多，點(diǎn)也更圓，而且沒有圖B中的橫條紋。說(shuō)明主動(dòng)水化比被動(dòng)水化的聚焦效果更好。

3討論

雙向凝膠電泳(2-DE)由于其在展現(xiàn)全部蛋白質(zhì)表達(dá)轉(zhuǎn)變并鑒定特異性蛋白方面的優(yōu)勢(shì)，成為目前蛋白質(zhì)組學(xué)討論首選的分別技術(shù)，近年來(lái)得到了較大的進(jìn)展與改善，但試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性仍有待提高。我國(guó)關(guān)于肝癌的蛋白質(zhì)組學(xué)討論越來(lái)越多，由于肝癌組織成分簡(jiǎn)單，干擾成分多，個(gè)體差異大使其雙向電泳試驗(yàn)條件難以嚴(yán)格掌握，目前尚沒有針對(duì)該組織的雙向電泳技術(shù)的方法學(xué)的系統(tǒng)報(bào)道，為此，我們對(duì)肝癌組織蛋白的制備、一向聚焦程序、上樣方法等關(guān)鍵步驟進(jìn)行討論對(duì)比，優(yōu)化總結(jié)出一套可行的，重復(fù)性好的雙向電泳方法，供大家參考。

3.1樣品制備

蛋白質(zhì)樣品的制備是的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，關(guān)系到蛋白質(zhì)組討論結(jié)果的精確?????性。樣本制備主要包括蛋白提取與沉淀兩個(gè)步驟。蛋白提取過程需盡可能地溶解和解聚蛋白質(zhì)。通常采納分級(jí)提取蛋白的方法，但是繁瑣的樣品制備步驟簡(jiǎn)單造成

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樣品中蛋白質(zhì)組分的丟失。為了盡可能削減蛋白丟失，我們采納液氮冷凍研磨的方法提取蛋白。另外，裂解液的選擇也特別關(guān)鍵。目前常用的裂解液配方有兩種：第一種，7mmol/L尿素，4%(CHAPS)，0.5%的IPG，0.1mmol/LDTT;其次種，將8mmol/L尿素改為7mmol/L尿素，2mmol/L硫脲。后者添加了硫脲，它可以增加蛋白的溶解，特殊是溶解疏水蛋白。Fialka在對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的蛋白提取中，添加了硫脲，獲得一系列的亞細(xì)胞器膜蛋白的如跨膜蛋白Ecadherin等。為了盡可能得到肝癌組織的全蛋白，我們采納了含硫脲的裂解液。

蛋白沉淀，目前還有很多問題沒有解決，如沉淀后蛋白的溶解，特殊是一些疏水蛋白、低豐度蛋白等不簡(jiǎn)單重溶，而它們可能是藥物的靶向位點(diǎn)，或是腫瘤細(xì)胞的表面抗原，在疾病發(fā)生過程中發(fā)揮重要的作用。肝癌樣本中含有的脂肪、核酸和大量的鹽分，影響等電聚焦。鹽離子在水化過程中簡(jiǎn)單滲入膠條，使凝膠內(nèi)產(chǎn)生不均一的電流分布，導(dǎo)致雙向電泳結(jié)果消失條紋和不均一背景。因此，必需采納蛋白沉淀的方法去除這些雜質(zhì)，才能順當(dāng)?shù)赝瓿删劢?。目前，已有不少有關(guān)樣本沉淀的報(bào)道，最常使用丙酮沉淀法，TCA-丙酮沉淀法，和商業(yè)化的Cleaning-upkit來(lái)沉淀蛋白，但沉淀的效果如何，卻沒人做過系統(tǒng)的比較分析。本文將這三種沉淀方法都進(jìn)行試驗(yàn)，TCA-丙酮沉淀法蛋白丟失較多，與它的作用原理有關(guān)。蛋白質(zhì)在pH值小于等電點(diǎn)的環(huán)境中帶上正電荷，與TCA的酸根結(jié)合生成不溶鹽而沉淀，再用丙酮將酸根完全抽提，獲得較純的蛋白質(zhì)樣品。因此它對(duì)堿性蛋白的富集效果較好，但對(duì)等電點(diǎn)小于溶液pH值的酸性蛋白富集效果差，有機(jī)溶劑的多次作用造成了蛋白質(zhì)溶解性變差也加劇了蛋白質(zhì)的丟失。圖1B中用TCA-丙酮沉淀后酸端蛋白丟失很明顯。

丙酮沉淀法是通過降低水的介電常數(shù)，破壞蛋白質(zhì)膠體的水化層，形成沉淀析出。但是，蛋白質(zhì)分子在常溫或升溫時(shí)立體結(jié)構(gòu)綻開，丙酮極簡(jiǎn)單與其中的色氨酸、酪氨酸等氨基酸進(jìn)行疏水結(jié)合導(dǎo)致蛋白變性，因此整個(gè)沉淀過程應(yīng)使用預(yù)冷的丙酮。Cleaning-up試劑盒是商家進(jìn)行改良后的沉淀法，也獲得了很好的電泳圖譜，但相比之下，丙酮具有經(jīng)濟(jì)便利等優(yōu)點(diǎn)，所以我們

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推舉使用丙酮沉淀法。

3.2聚焦程序

一向聚焦是雙向電泳勝利的關(guān)鍵，但好的聚焦程序是怎樣摸索出來(lái)的呢?我們的閱歷是首先依據(jù)IEF的原則編排基礎(chǔ)聚焦程序;再依據(jù)樣本是否除鹽打算低壓聚焦的步驟準(zhǔn)時(shí)間;最終的聚焦電壓以5～8kV為適，聚焦時(shí)間以10h為基礎(chǔ)進(jìn)行調(diào)整。為了確保試驗(yàn)的重復(fù)性，最終聚焦要選擇千伏結(jié)束。此外，在IEF過程中，利用軟件對(duì)聚焦時(shí)的電壓，電流進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，指導(dǎo)低壓聚焦時(shí)間及步驟的調(diào)整。如電流過高，可在低電壓處延長(zhǎng)聚焦時(shí)間，利用低壓達(dá)到除鹽的效果。

3.3上樣方法

一向等電聚焦最常用的上樣方法包括主動(dòng)水化和被動(dòng)水化。主動(dòng)水化中，由于施加低電壓有利于大分子蛋白的進(jìn)入膠條，可避開杯上樣所產(chǎn)生的滲漏問題。被動(dòng)水化法可任意調(diào)整上樣位置，所以特殊適合偏酸或偏堿蛋白的聚焦;最高電流可達(dá)75?滋A，因此對(duì)鹽的耐受力量較強(qiáng);同時(shí)具有避開蛋白在長(zhǎng)時(shí)間的低電壓水化過程中丟失等優(yōu)點(diǎn)。但有些蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)靠近上樣處，遷移率及溶解性降低，易沉淀在上樣杯處，在二相電泳中表現(xiàn)為在上樣處形成條紋狀。試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)當(dāng)依據(jù)樣本類型和試驗(yàn)需要進(jìn)行選擇。本試驗(yàn)中，肝癌組織蛋白主要在pH3～10之間，通過比較，我們選擇主動(dòng)水化。

蛋白質(zhì)組學(xué)試驗(yàn)涉及的步驟許多，除了上述關(guān)鍵步驟，還有凝膠濃度，染色方法的選擇等。試驗(yàn)時(shí)要依據(jù)感愛好的蛋白的分子量選擇凝膠濃度，常規(guī)選擇125g/L的分散;假如大分子質(zhì)量的蛋白較多可以選擇100g/L的凝膠，相反，假如小分子質(zhì)量的蛋白多，則選擇150g/L的凝膠。常用的染色方法有考染、膠體考染、銀染、熒光染色等。一般上樣量大于300μg時(shí)可選擇考染或膠體考染;上樣量在100～300μg選擇銀染;小于100μg選擇熒光染色。

我國(guó)肝癌組織蛋白質(zhì)組學(xué)討論已有許多報(bào)道，但沒有系統(tǒng)的總結(jié)雙向電泳的方案。本討論充分結(jié)合肝癌組織成分特點(diǎn)及雙向電泳的詳細(xì)要求，從雙向電泳的全過程進(jìn)行探討，通過試驗(yàn)獲得抱負(fù)的雙向電泳圖譜，形成了一套用于肝癌蛋白質(zhì)組學(xué)討論的穩(wěn)定牢靠的雙向電泳技術(shù)方案，供從事肝癌蛋白質(zhì)組學(xué)討論人員參考，為進(jìn)一步的蛋白質(zhì)組學(xué)分析奠定基礎(chǔ)。

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