三重復(fù)合誘變和原生質(zhì)體融合技術(shù)篩選林可霉素高產(chǎn)菌株項(xiàng)目可行性實(shí)施報(bào)告

三重復(fù)合誘變和原生質(zhì)體融合技術(shù)篩選林可霉素高產(chǎn)菌株項(xiàng)目可行性實(shí)施報(bào)告月進(jìn)展起來的雜交育種方法受到遺傳標(biāo)記的限制,應(yīng)用較少。

雖然皖北藥業(yè)股份利用先進(jìn)的基因工程技術(shù)對林可霉素菌種進(jìn)展改進(jìn)、篩選出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的林可霉素產(chǎn)生菌,搖瓶效價(jià)到達(dá)4500μ以上。

應(yīng)用于生產(chǎn)后,使發(fā)酵單位提高到6000μ以上,同比增長40%。

但是國潔霉素還是處于生產(chǎn)水平偏低的狀況。

目前,利用離子注入技術(shù)對抗生素產(chǎn)生菌誘變處理國已有一些報(bào)道[16,]氮離子注入技術(shù)用于林可霉素產(chǎn)生菌的誘變,取得了確定的效果。

本試驗(yàn)通過三重誘變〔熱誘變--〕處理林可霉素生產(chǎn)菌與抗終點(diǎn)代謝物突變株的篩選,以期能提高其產(chǎn)林可霉素的力氣,且利用正交設(shè)計(jì)來優(yōu)化經(jīng)過三重誘變后的高產(chǎn)菌的發(fā)酵培育基和發(fā)酵工藝來進(jìn)一步提高林可霉素產(chǎn)量。

〔三〕相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域國外進(jìn)呈現(xiàn)狀、趨勢林可霉素,屬于林可***類抗生素,是由-酪氨酸和戊糖磷酸循環(huán)戊糖-5-磷酸和景天糖-7-磷酸的中間產(chǎn)物縮合而成的。

整個(gè)生物合成途徑包括兩個(gè)分支:一個(gè)由-酪氨酸合成丙脯氨酸,另一個(gè)由景天糖-7-磷酸構(gòu)成α-甲硫林可***α-。

林可鏈霉菌合成一共需18種酶的參加:8個(gè)酶參加合成,另8個(gè)酶參加α-合成,還有2個(gè)酶把握縮合兩個(gè)組分形成終產(chǎn)物。

此外,還覺察了一個(gè)小分子組分,以關(guān)懷合成因子形式7,8-二脫***-8-羥基-5-氮化核黃素參加生物合成途徑中的催化反響。

林可霉素是于1962年從鏈絲菌變異株的好氧發(fā)酵液中獲得的抗生素,、溶血性鏈球菌、草綠色鏈球菌與金黃色葡萄球菌的感染。

特殊用于嚴(yán)峻厭氣菌引起的感染與金黃色葡萄球菌骨髓炎,在許多感染癥的治療中療效顯著。

由于其對組織和細(xì)胞的穿透力強(qiáng),應(yīng)用便利,...216不需做皮試。

林可霉素用藥途徑較多,副反響較少,把握感染快,是較有前途的一種抗生素。

利用菌種改進(jìn)技術(shù)提高抗生素的產(chǎn)量、質(zhì)量是增加抗生素生產(chǎn)效益的最有效途徑,基因工程菌的構(gòu)建是當(dāng)今育種技術(shù)進(jìn)展的熱點(diǎn),但由于許多抗生素合成相關(guān)基因與其功能尚未把握,且已構(gòu)建的工程菌經(jīng)常發(fā)生性狀丟失,所以基因技術(shù)應(yīng)用受到極大限制。

傳統(tǒng)育種方法,盲目性大、實(shí)效差,在2世紀(jì)7年月進(jìn)展起來的雜交育種方法受到遺傳標(biāo)記的限制,應(yīng)用較少。

雖然皖北藥業(yè)股份利用先進(jìn)的基因工程技術(shù)對林可霉素菌種進(jìn)展改進(jìn)、篩選出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的林可霉素產(chǎn)生菌,搖瓶效價(jià)到達(dá)4500μ以上。

但是國林可霉素還是處于生產(chǎn)水平偏低的狀況。

目前,利用離子注入技術(shù)對抗生素產(chǎn)生菌誘變處理國已有一些報(bào)道,氮離子注入技術(shù)用于林可霉素產(chǎn)生菌的誘變,取得了確定的效果。

長期以來,醫(yī)藥市場中抗感染藥物的銷售額始終位居第一,現(xiàn)在年銷售額已達(dá)300多億元。

林可霉素在我國的應(yīng)用已有多年歷史,正處市場銷售成熟期。

目前全國林可霉素生產(chǎn)廠家有40多家,每年原料藥產(chǎn)量達(dá)1900噸左右,其中出口約700余噸,國應(yīng)用1200噸左右。

紫外、氮離子注入技術(shù)、快中子處理技術(shù)、熱誘變等物理誘變方法運(yùn)用于林肯鏈霉菌的誘變育種中,取得了確定的成果。

國一些廠家發(fā)酵生產(chǎn)林可霉素雖有幾十年的歷史,但生產(chǎn)水平始終徘徊不前。

緣由主要有以下三方面:缺乏高產(chǎn)菌株,或者菌種退化;工藝有待優(yōu)化;生產(chǎn)治理不善〔責(zé)任心不強(qiáng)、操作工素養(yǎng)不高、工藝變形〕。

〔四〕工程申請單位、主要合作申請單位與工程主要負(fù)責(zé)人的根本狀況工程申請單位根本狀況...216某師高校生命科學(xué)學(xué)院現(xiàn)有生物科學(xué)和生物工程本科專業(yè)。

。

學(xué)院現(xiàn)有教職工32人,其中教授6名,副教授8名,具有博士學(xué)位的老師16名,全省高校中青年骨干老師2名。

,學(xué)院擁有生物工程綜合試驗(yàn)室、省重點(diǎn)試驗(yàn)室,專業(yè)圖書資料室藏書1600余冊,中外文期刊近百種,還建有科研試驗(yàn)基地。

目前,學(xué)院正以鄱陽湖重點(diǎn)試驗(yàn)室建設(shè)為契機(jī),圍繞省學(xué)科建設(shè),加強(qiáng)對外溝通與合作,努力實(shí)現(xiàn)高位嫁接,與中國科學(xué)院廬山植物園建立植物生態(tài)聯(lián)合試驗(yàn)室。

重點(diǎn)試驗(yàn)室擁有本工程的先進(jìn)生物工程設(shè)備,包括全自動發(fā)酵罐和用于產(chǎn)物分析檢測的高壓液相儀。

主要合作申請單位根本狀況某國藥始創(chuàng)于一九五五年,系由原某國藥廠于一九九四年依法改制組建的國有獨(dú)資,現(xiàn)隸屬于某省醫(yī)藥集團(tuán)公司。

公司有近50年中藥生產(chǎn)和30余年西藥生產(chǎn)歷史。

現(xiàn)有資產(chǎn)總額41228萬元,凈資產(chǎn)10378萬元。

主要生產(chǎn)設(shè)備3300余臺套,生產(chǎn)發(fā)酵容量2100立方米,動力系統(tǒng)水、電、汽、空氣、冷凍、真空等與生產(chǎn)相配套,其規(guī)模在某省醫(yī)藥行業(yè)位居前列。

公司目前固體制、原料藥已經(jīng)通過檢查。

公司一貫留意科技進(jìn)步,:某,女,教授,任職于某師高校生命科學(xué)爭辯院。

1992年獲華東理工高校生物化工專業(yè)“工學(xué)碩士”學(xué)位。

2023年晉升為教授。

2023年獲華東理工高校生物化工專業(yè)“工學(xué)博士”學(xué)位。

曾主要從事發(fā)酵工程和基因工程工程與生化分別技術(shù)的科研和教學(xué)工作。

在國外學(xué)術(shù)刊物發(fā)表爭辯論文11篇;曾獲市第四屆化學(xué)化工爭辯生論文報(bào)告會優(yōu)秀論文獎。

2023年九月進(jìn)入中科院生命科學(xué)爭辯院植物生理生態(tài)爭辯所微生物次生代謝調(diào)控爭辯室做博士后爭辯,進(jìn)展-氨基酸氧化基因的表達(dá)與酶工程的爭辯。

并于2023年3月出站到某師高校生命科學(xué)學(xué)院任...216教。

〔五〕有關(guān)本工程的現(xiàn)有工作根底和支撐條件本課題組有多年從事微生物學(xué)和酶工程的老師與長期從事抗生素生產(chǎn)的國藥的中級技師和高級工程師,還有微生物學(xué)爭辯方向的爭辯生,在人才方面能保證本工程順當(dāng)進(jìn)展。

試驗(yàn)室現(xiàn)有大型儀器設(shè)備比較齊全、真空冷凍枯燥器、高速冷凍離心機(jī)、帶有尾氣分析的30高級生物反響器等。

還需添置一些儀器:微生物培育搖床、生化培育箱、蛋白電泳儀、旋光儀、臺式高速離心機(jī)、5升全自動發(fā)酵罐,購置試驗(yàn)用微生物學(xué)試劑和微生物培育基與其他生化試劑。

二、工程實(shí)施方案〔一〕工程到達(dá)的目標(biāo)與考核的主要技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)〔含學(xué)問產(chǎn)權(quán)、技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)〕技術(shù)指標(biāo):林可霉素發(fā)酵單位由現(xiàn)在的5000到達(dá)7000,提高林可霉素產(chǎn)量40%。

經(jīng)濟(jì)指標(biāo):林可霉素原料藥年產(chǎn)量由20噸提高到28噸,經(jīng)濟(jì)效益提高40%。

〔二〕工程的主要爭辯〔開發(fā)〕容爭辯容:,在生產(chǎn)過程中,不經(jīng)過人工處理,利用菌種的自然突變,多因素低劑量的誘變效應(yīng)來篩選穩(wěn)定生產(chǎn)林可霉素的突變株;以林可霉素生產(chǎn)菌為動身菌株,承受加熱、紫外線、三重復(fù)合誘變處理,用林可霉素和前體為選擇壓力,壓力梯度法篩選耐自身終產(chǎn)物的高產(chǎn)菌種與用甲硫氨酸為前體物篩選耐前體物的高產(chǎn)菌種;用雙親本菌株原生質(zhì)體融合技術(shù)篩選高產(chǎn)穩(wěn)定的林可霉素菌株;高產(chǎn)穩(wěn)定融合菌株發(fā)酵培育基與發(fā)酵工藝優(yōu)化與中試放大。

〔三〕試驗(yàn)〔開發(fā)〕規(guī)模與地點(diǎn)本申請工程是中試工藝開發(fā)工程,本工程主要依托于某師高校生命科學(xué)學(xué)院省重...216...點(diǎn)鄱陽湖試驗(yàn)室完成,爭辯容主要包括三重復(fù)合誘變動身菌株,用林可霉素和前體為選擇壓力,壓力梯度法篩選耐自身終產(chǎn)物的高產(chǎn)菌種與用甲硫氨酸為前體物篩選耐前體物的高產(chǎn)菌種;承受雙親本菌株原生質(zhì)體融合技術(shù)篩選高產(chǎn)穩(wěn)定的林可霉素菌株;在30立上升級生物反響器中進(jìn)展高產(chǎn)穩(wěn)定融合菌株發(fā)酵培育基與發(fā)酵工藝優(yōu)化與中試放大。

本工程產(chǎn)業(yè)化在某國藥進(jìn)展。

〔四〕主要技術(shù)關(guān)鍵與創(chuàng)點(diǎn)三重誘變的優(yōu)點(diǎn):第一,誘變效率較高,即產(chǎn)生點(diǎn)突變的頻率相對較高,而染色體畸變相對較少,并且誘變圍廣。

因而可被用來對微生物的某一特殊性狀進(jìn)展改良,并且簡潔毀滅高產(chǎn)的突變體。

其次,毀滅的突變體類型較多。

盡管主要引起的是-堿基對之間的轉(zhuǎn)換,同時(shí)也由于兩種不同的誘變方式結(jié)合,使得突變位點(diǎn)增加,突變方式多樣。

在突變過程中可毀滅其它各種類型的突變體,因而具有多效性。

第三,與其它誘變方法相比,三重誘變后產(chǎn)生的顯性突變體相對較多,因而易于篩選突變體。

〔六〕實(shí)施方案〔含技術(shù)路線、工藝流程與技術(shù)關(guān)鍵的解決方案〕抗終點(diǎn)代謝物突變株的初篩動身菌株的自然分別三重復(fù)合誘變〔熱誘變、、〕耐前體物突變株初篩制備親本原生質(zhì)體溶菌酶親本〔高產(chǎn)林可霉素突變株〕高產(chǎn)林可霉素突變菌株的復(fù)篩制備親本原生親本〔自然選育質(zhì)體溶菌酶特定的菌株〕9162023融合細(xì)胞壁再生篩選高產(chǎn)穩(wěn)定融合細(xì)胞高產(chǎn)菌株發(fā)酵培育基與發(fā)酵工藝優(yōu)化中試放大技術(shù)路線:...1016試驗(yàn)方案:%的生理鹽水刮洗下來,然后用玻璃珠在搖床200搖床上振蕩20過濾后制成單孢子懸浮液。

從孢子懸浮液中吸取1,參與9無菌水中將其稀釋成10-1,然后再稀釋成10-2,10-3,10-4,10-5,10-6。

〔3〕將10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,,30℃培育7天。

依據(jù)菌落形態(tài),選擇出60株不同形態(tài)的菌株接到60個(gè)大試管斜面中30℃,培育7天。

〕一一對應(yīng)地將60株培育基試管斜面分別挖塊接種于母瓶中,置于30℃,220,置于30℃,220的搖床培育7天。

測定效價(jià)三重誘變從試管斜面取下孢子制備成孢子懸浮液,用棉花漏斗過濾后,用10吸管吸取10懸浮液裝入250三角瓶中,從中取出1懸浮液放入9無菌水