不同梯度細胞凍存方式的應用的制作方法

不同梯度細胞凍存方式的應用的制作方法引言細胞凍存是一種常用的技術(shù)，能夠延長實驗中的細胞存儲時間，同時也是對細胞進行長期保護的方法。隨著技術(shù)的進步，人們發(fā)現(xiàn)不同的梯度細胞凍存方式能夠適用于不同類型的細胞，并且提高了細胞凍存的效率和成功率。本文主要介紹不同梯度細胞凍存方式的制作方法，幫助讀者更好地了解和掌握這些技術(shù)。一、Percoll梯度離心法Percoll梯度離心法是一種常用的細胞凍存方法，特別適用于淋巴細胞和血細胞的凍存。該方法的制作主要包括以下幾個步驟：1.準備Percoll溶液取1mol/LNaCl制備PBS緩沖液；用PBS沖稀Percoll（20%）至10%的濃度，制成Percoll溶液；注意：制作中要注意消泡，避免空氣泡影響到細胞的分歧。2.收集細胞將需要凍存的細胞用PBS低速離心（1000rpm、8min），棄掉上清液，收集沉淀。3.制備細胞懸液向細胞沉淀中滴加滴加1mL/ml的PBS滲透液，輕輕攪拌，避免產(chǎn)生泡沫。4.添加Percoll溶液將制好的Percoll溶液注入離心管底部。按下列梯度層次從上至下依次加入：45%Percoll液體，重心位于液面上部；30%Percoll液體，重心位于液面中下部；5%Percoll液體，重心位于離心管筒底。5.細胞離心慢速離心，以便縮小懸浮細胞與Percoll溶液的差異。先加快離心轉(zhuǎn)速（加速度為2000G），達到保留“粉色帶”至少10分鐘。然后將Percoll中的細胞建立到泡沫中，并在離心管上部添加PBS（3000rpm，20min，4℃）來清除Percoll，并拉伸上清液即可。6.凍存細胞將凍存用的細胞加入適當體積的10%DMSO或1mol/L冰凍甘油液中混合均勻，并逐滴加到冰凍管中。在嚴格控制冷卻速度中，放入二甲基亞砜（DMSO）內(nèi)部，低于-70℃儲存。這樣處理的凍細胞應該立即放入氮罐中，保存于液氮中，以便將來的應用。二、Ficoll梯度離心法Ficoll梯度離心法是一種較為通用的細胞凍存技術(shù)，適用于多種不同類型的細胞。該方法的制作主要包括以下幾個步驟：1.制備Ficoll梯度液將Ficoll-PA40在70mlNB+復合液（NB+即細胞相關(guān)液體）中溶解，接著使用氣流抽泵進行混合，最后加入到離心管中。2.細胞離心收集需要凍存的細胞，然后將其濃縮在0.5ml完全游離培養(yǎng)基中，緩慢加入等體積的Ficoll梯度液。3.快速離心使用高速離心進行通過，以分離細胞和梯度液。為了避免細胞凝聚或損壞，建議設置離心保護，使用較為溫和的離心條件。4.凍存細胞將凍存用的細胞和冰冷的細胞凍存保護劑混合在一起，包裝到液氮罐中冷凍。三、Histopaque梯度離心法Histopaque梯度離心法是一種常用的細胞分離和凍存方法，適用于不同類型的細胞，尤其適用于血液細胞和骨髓細胞的分離和凍存。該方法的制作主要包括以下幾個步驟：1.制備Histopaque1077液使用PBS稀釋Histopaque1077溶液至10%濃度。2.細胞離心將待凍存的細胞樣本離心在轉(zhuǎn)速為400g的離心機上（轉(zhuǎn)速時間為30min）。3.添加Histopaque液取出棕色管口軟管，將離心后的上清液倒入軟管。加入等體積的10%Histopaque溶液（盡可能慢地加入）。4.快速離心將軟管立即離心以使細胞沉積在Histopaque表面上。5.取出細胞用微調(diào)鑷或吸管等工具在第3步中離心后的上層離心液中取出細胞。6.凍存細胞將細胞與冷卻的細胞凍存保護劑混合均勻，并儲存在液氮罐中，保存于液氮中。結(jié)論以上介紹的三種梯度細胞凍存方式都是比較常用的方法，對不同類型的細胞都能夠產(chǎn)生良好的凍存效果。