水產(chǎn)品微生物的檢驗-副溶血性弧菌檢驗

副溶血性弧菌的測定范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）的檢驗方法，適用于食品中副溶血性弧菌的檢驗。

設(shè)備和材料恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、恒溫水浴箱、均質(zhì)器、天平、無菌試管、無菌吸管、無菌錐形瓶、無菌培養(yǎng)皿、全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)、無菌手術(shù)剪、鑷子、滅菌設(shè)備副溶血性弧菌檢驗培養(yǎng)基

3％氯化鈉堿性蛋白胨水、硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（TCBS）瓊脂、3％氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂、3％氯化鈉三糖鐵瓊脂、嗜鹽性試驗培養(yǎng)基、3％氯化鈉甘露醇試驗培養(yǎng)基、3％氯化鈉賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基、3％氯化鈉MR-VP培養(yǎng)基、我妻氏血瓊脂試劑3％氯化鈉溶液、氧化酶試劑、革蘭氏染色液、ONPG試劑、V-P試劑、生化鑒定試劑盒溶血性弧菌檢驗檢驗程序副溶血性弧菌檢驗操作步驟

樣品制備非冷凍樣品置7℃~10℃冰箱保存，盡早檢驗；冷凍樣品在45℃以下、15min內(nèi)或2℃~5℃、18h內(nèi)解凍。魚類和頭足類動物取表面組織、腸或鰓；貝類取全部內(nèi)容物（貝肉和體液）；甲殼類取整個動物或中心部分（腸和鰓）。帶殼類，則應(yīng)先在自來水中洗刷外殼并甩干表面水分，然后以無菌操作打開外殼再取樣。以無菌操作取樣品25g（mL），加入3%氯化鈉堿性蛋白胨水225mL，以8000r/min均質(zhì)1min，制備成1:10的樣品勻液。副溶血性弧菌檢驗操作步驟

增菌定性檢驗將1:10樣品勻液于36℃±1℃培養(yǎng)8h~18h。定量檢測

吸取1:10樣品勻液1mL，注入含有9mL3%氯化鈉堿性蛋白胨水的試管內(nèi)，制備1:100的樣品勻液。另取1mL無菌吸管，依次制備10倍系列稀釋樣品勻液。選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度，每個稀釋度接種3支含有9mL3%氯化鈉堿性蛋白胨水的試管，每管接種1mL。置36℃±1℃恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng)8h~18h。副溶血性弧菌檢驗操作步驟

分離對所有顯示生長的增菌液，用接種環(huán)在距離液面以下1cm內(nèi)沾取一環(huán)增菌液，于TCBS平板或弧菌顯色培養(yǎng)基平板上劃線分離，于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈圓形、半透明、表面光滑的綠色菌落，用接種環(huán)輕觸，有類似口香糖的質(zhì)感，直徑2mm~3mm。按典型的副溶血性弧菌在弧菌顯色培養(yǎng)基上的特征進(jìn)行判定。副溶血性弧菌檢驗操作步驟

純培養(yǎng)

挑取3個或以上可疑菌落，劃線接種3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。

初步鑒定

氧化酶試驗：挑選單個菌落涂布在氧化酶試劑濕潤的濾紙上，10s內(nèi)呈現(xiàn)粉紅或紫紅色，為氧化酶陽性。涂片鏡檢：將可疑菌落涂片，鏡檢呈棒狀、弧狀、卵圓狀等多形態(tài)，無芽胞，有鞭毛；革蘭氏染色陰性，呈紅色。副溶血性弧菌檢驗操作步驟

初步鑒定

穿刺試驗：挑取單個可疑菌落，轉(zhuǎn)種3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面并穿刺底層，36℃±1℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果，應(yīng)呈現(xiàn)底層變黃不變黑，無氣泡，斜面顏色不變或紅色加深，有動力的特征。嗜鹽性試驗：挑取單個可疑菌落，分別接種0%、6%、8%和10%不同氯化鈉濃度的胰胨水，36℃±1℃培養(yǎng)24h，觀察液體混濁情況。副溶血性弧菌在無氯化鈉和10%氯化鈉的胰胨水中不生長或微弱生長，在6%氯化鈉和8%氯化鈉的胰胨水中生長旺盛。副溶血性弧菌檢驗操作步驟

確定鑒定

取純培養(yǎng)物分別接種含3%氯化鈉的甘露醇試驗培養(yǎng)基、賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基、MR-VP培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)24h~48h后觀察結(jié)果；3%氯化鈉三糖鐵瓊脂隔夜培養(yǎng)物進(jìn)行O