基于熒光免疫層析技術(shù)快速評(píng)價(jià)新型冠狀病毒肺炎病毒-cov-2抗體水平的方法

基于熒光免疫層析技術(shù)快速評(píng)價(jià)新型冠狀病毒肺炎病毒-cov-2抗體水平的方法

2019年12月以來，一些醫(yī)院相繼報(bào)告了許多無法解釋的肺炎。由于春節(jié)期間人口流動(dòng)性很高，2020年1月該肺炎迅速傳播到整個(gè)中國目前對(duì)COVID-19患者的檢測(cè)主要采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法、化學(xué)發(fā)光法以及膠體金法。熒光定量PCR法檢測(cè)人體內(nèi)提取出的核酸時(shí)靈敏度較低，容易出現(xiàn)假陰性，同時(shí)由于此類方法的檢測(cè)時(shí)間長，對(duì)于檢測(cè)環(huán)境的要求高，不宜于基層醫(yī)院普及SARS-CoV-2核衣殼(N)蛋白是一種豐富的RNA結(jié)合蛋白，可在病毒的生命周期中發(fā)揮多種作用本研究基于NC蛋白建立了SARS-CoV-2抗體熒光免疫層析檢測(cè)方法，通過對(duì)其精密度和穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，配合相應(yīng)的熒光分析儀，實(shí)現(xiàn)了人體內(nèi)SARS-CoV-2抗體水平的評(píng)價(jià)。整套系統(tǒng)操作簡便，成本低廉，能夠在15min內(nèi)即時(shí)完成檢測(cè)，大大降低了檢測(cè)時(shí)間，可有效提升復(fù)工復(fù)學(xué)群體的檢測(cè)效率。1實(shí)驗(yàn)部分1.1微生物細(xì)胞的免疫熒光微球(FMs,美國BangsLab公司),1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)(中國Aladdin公司),2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物(MES)緩沖液、樣品稀釋液、包被液、微球保護(hù)液、微球封閉液、羊抗鼠IgG、鼠IgG、NF蛋白、BL21(DE3)/pET21b-NC菌株、SARS-CoV-2陰性樣本和免疫NC抗原兩周的兔血清(中國河南省生物工程技術(shù)研究中心)。PVC板和吸水紙(中國通成紙業(yè)),玻璃纖維素膜(中國JYBiotech公司),XYZ三維點(diǎn)膜噴金儀和微電腦自動(dòng)斬切機(jī)(中國上海金標(biāo)生物科技有限公司),熒光免疫層析讀數(shù)儀(中國杭州峰航科技有限公司),高電流電泳儀(美國Bio-Rad公司)。1.2鼠igg抗體結(jié)合原理本實(shí)驗(yàn)采用雙抗夾心法檢測(cè)血清中SARS-CoV-2抗體的水平。將待測(cè)血清和樣本稀釋液按照一定比例混合后加入加樣孔中，血清中的SARS-CoV-2抗體會(huì)和結(jié)合墊上的熒光標(biāo)記抗原結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物，并通過毛細(xì)作用沿著液體層析方向移動(dòng)，隨后通過層析作用逐漸在硝酸纖維素膜(NC膜)上移動(dòng)，最后被固定在檢測(cè)線(T線)上的包被抗原特異性地捕獲，形成抗原-抗體-抗原復(fù)合物，而鼠IgG繼續(xù)移動(dòng)與質(zhì)控線(C線)上的羊抗鼠IgG抗體結(jié)合。其原理如圖1所示。當(dāng)檢測(cè)卡插入熒光檢測(cè)儀后，儀器自動(dòng)讀取檢測(cè)卡上T線和C線的熒光信號(hào)強(qiáng)度，T/C值可表示待測(cè)血清中SARS-CoV-2抗體的水平1.3培養(yǎng)基和培養(yǎng)基1∶100接種菌株BL21(DE3)/pET21b-NC于1.2LLuria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基中(含100μg/mL氨芐青霉素),37℃條件下振蕩培養(yǎng)至OD1.4edc/mes溶液制備取1%固含量的200nm熒光微球40μL于1.5mL離心管中，加入1mL純化水后在15000r/min條件下離心15min。棄上清液后加入1mL20mmol/LMES(pH6.0)緩沖液振蕩混勻，再加入10mg/mLEDC溶液30μL,振蕩混勻，繼續(xù)加入20mg/mLNHS溶液80μL,水浴超聲120s混勻。將其置于臺(tái)式恒溫振蕩器中避光活化30min,然后在15000r/min條件下離心15min,棄上清液后加入1mL20mmol/LMES(pH6.0)緩沖液，超聲混勻。1.5鼠igg的模擬在上述溶液中加入待標(biāo)記抗原30μg振蕩混勻，避光條件下偶聯(lián)1h,繼續(xù)加入20μg鼠IgG,避光條件下偶聯(lián)1h。偶聯(lián)完成后，于15000r/min條件下離心15min,棄上清液，加入封閉液1mL,超聲混勻避光條件下封閉1h。封閉完成的熒光微球于15000r/min條件下離心15min,棄上清液，加入微球保護(hù)液1mL,超聲混勻。1.6熒光微球偶聯(lián)物的制備將包被抗原和羊抗鼠IgG噴于硝酸纖維素膜的T線和C線上，質(zhì)量濃度均為0.5mg/mL,兩帶間隔4mm,置于真空干燥箱中抽真空干燥2h。將制備的熒光微球偶聯(lián)物稀釋后用XYZ噴金劃膜儀噴涂于結(jié)合墊上，置真空干燥箱中抽真空干燥5h。將樣品墊、結(jié)合墊以及吸水紙按照一定順序組裝在PVC板上，使用微電腦自動(dòng)斬切機(jī)將組裝好的PVC板切成寬度為3.9mm的試紙條(試紙條結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示),將試紙條裝入特定的塑料檢測(cè)卡中，以壓卡機(jī)壓緊檢測(cè)卡上下蓋，置于干燥房待用。1.7熒光免疫層析檢測(cè)血清中ss-cov-2抗體基因型別在室溫下將待測(cè)血清和樣本稀釋液按照一定比例混合，用移液器吸取80μL稀釋后的血清，垂直懸空緩慢加入到樣品墊上，15min后在熒光免疫層析讀數(shù)儀上進(jìn)行檢測(cè)，讀取對(duì)應(yīng)的T、C值。無論樣品中是否含有SARS-CoV-2抗體，C線都應(yīng)出現(xiàn)熒光條帶，否則試紙條檢測(cè)結(jié)果判定為無效。試紙條檢測(cè)結(jié)果示意圖如圖3所示2結(jié)果與討論2.1透皮吸收tis緩沖液洗脫目的蛋白本實(shí)驗(yàn)在對(duì)重組菌株BL21(DE3)/pET21b-NC進(jìn)行培養(yǎng)后，使用鎳親和層析法純化蛋白，以含100mmol/L咪唑的20mmol/LTris(pH8.0,300mmol/LNaCl)緩沖液洗滌雜蛋白，含300mmol/L咪唑上述Tris的緩沖液洗脫目的蛋白。20mmol/LTris(pH8.0)緩沖液透析目的蛋白除去咪唑和NaCl后，以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)鑒定，結(jié)果見圖4。純化后得到了單一的目的條帶，大小約13kD。2.2不同標(biāo)準(zhǔn)兔血清t/c值的檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)選擇NF蛋白以及NC蛋白進(jìn)行配對(duì)組合，使用時(shí)間分辨免疫層析法對(duì)其陰性和陽性進(jìn)行評(píng)價(jià)，綜合篩選出較優(yōu)抗原配對(duì)組合?？乖鋵?duì)方式為兩組，均選擇NF蛋白作為包被抗原，a組使用NF標(biāo)記，b組使用NC標(biāo)記，按照“1.4”、“1.5”以及“1.6”中的方法制備試紙條。陰性檢測(cè)時(shí)將50份待檢測(cè)陰性樣本(N1～N50)使用樣本稀釋液稀釋10倍后進(jìn)行檢測(cè)，T值小于500,且T/C小于0.05即為符合要求；通過計(jì)算T/C值的平均值將兔血清稀釋10、20、40、80、160倍，并編號(hào)為P1、P2、P3、P4、P5,使用研制的試劑卡進(jìn)行檢測(cè)，T值大于1000,且T/C大于0.1即為符合要求；同時(shí)設(shè)置平行組，并在此基礎(chǔ)上使用樣本稀釋液對(duì)兔血清進(jìn)行稀釋，直至檢測(cè)結(jié)果不符合陽性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見表2。a組(NF包被，NF標(biāo)記)P3(血清稀釋至40倍時(shí))樣品的T值仍大于1000,且T/C大于0.1,P4(血清稀釋至80倍)樣品的T值小于1000,不符合陽性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)；b組(NF包被，NC標(biāo)記)P4(血清稀釋至80倍)樣品的T值仍大于1000,且T/C大于0.1,P5(稀釋至160倍)樣品的T值小于1000,不符合陽性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。由此可見，b組的靈敏度優(yōu)于a組。綜合陰性和陽性檢測(cè)結(jié)果，選擇b組(NF包被，NC標(biāo)記)抗原配對(duì)組合進(jìn)行性能檢測(cè)。2.3批間和批間的精密度本實(shí)驗(yàn)選擇N2、N15、P1、P3以及P55份樣本，分別對(duì)同批次試紙條進(jìn)行批內(nèi)精密度檢測(cè)，再分別對(duì)3個(gè)不同批次的試紙條進(jìn)行批間精密度檢測(cè)，每個(gè)待檢樣本重復(fù)檢測(cè)10次。計(jì)算每個(gè)待檢樣本的CV值，對(duì)批內(nèi)和批間精密度進(jìn)行考察，結(jié)果見表3。批內(nèi)各樣品T/C值的CV范圍為3.48%～10.05%;批間各樣品T/C值的CV范圍為4.77%～11.73%。批內(nèi)以及批間的CV均小于15%,在允許范圍之內(nèi)。2.4血清自身毒力基因檢測(cè)根據(jù)《2019新型冠狀病毒抗原/抗體檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審評(píng)要點(diǎn)》選擇肺炎支原體、甲型流感病毒、乙型流感病毒以及EB病毒陽性血清各3份，每份血清使用本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的試紙條重復(fù)檢測(cè)5次。另外檢測(cè)3份陰性對(duì)照血清，重復(fù)5次，分析其特異性。結(jié)果見表4,所有4種病毒陽性的血清以及陰性對(duì)照血清的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，說明該試紙條有良好的特異性。2.5檢測(cè)穩(wěn)定性測(cè)定將試紙條與干燥劑一起放入鋁箔袋中密封后，置于37℃干燥箱中保存。分別在3、6、9、12、15、18、21d時(shí)取出，于常溫環(huán)境中檢測(cè)。每個(gè)待檢樣本平行測(cè)定3次取平均值，樣本稀釋液4℃保存，考察其穩(wěn)定性。結(jié)果見圖5。試紙條在37℃干燥箱保存3、6、9、12、15、18、21d后，T值與放入當(dāng)天相比變化均在15%以內(nèi)，說明其穩(wěn)定性良好，可在37℃條件下保存21d。2.6兩種方法檢測(cè)的小鼠血清發(fā)熱伴呼吸道癥狀患者的血清符合率隨機(jī)抽取本實(shí)驗(yàn)制備的37個(gè)試紙條與廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的新型冠狀病毒抗體檢測(cè)試劑盒(膠體金法)同時(shí)對(duì)37份COVID-19患病者血清進(jìn)行檢測(cè)；并使用兩種方法檢測(cè)118例非COVID-19患病者血清，其中其他發(fā)熱伴呼吸道癥狀病例為76份，計(jì)算其符合率，結(jié)果見表5。兩種方法的總符合率為96.13%,陽性符合率為90.63%,陰性符合率為97.56%。表明兩種方法之間的相關(guān)性良好，本文所研制的試紙條具有一定的商用價(jià)值。3基層黨組織新型冠狀病毒肺炎疫情防控效果本實(shí)驗(yàn)基于截短新型冠狀病毒N蛋白開發(fā)的熒光免疫層析試紙條能夠快速評(píng)價(jià)體內(nèi)SAR