分析方法驗(yàn)證

液相色譜法方法驗(yàn)證島津國際貿(mào)易（上海）有限公司分析儀器事業(yè)部分析中心為什么要進(jìn)行方法驗(yàn)證？方法驗(yàn)證的目的

判斷該方法是否科學(xué)、合理，是否能有效控制藥品的內(nèi)在質(zhì)量。方法驗(yàn)證的流程

方法開發(fā)法規(guī)規(guī)定需要進(jìn)行考察的內(nèi)容制定驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)計(jì)劃(ValidationPlan)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)匯總和處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)確認(rèn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，填寫驗(yàn)證報(bào)告。由質(zhì)量負(fù)責(zé)人審批通過后以質(zhì)量管理文件形式保存定期回顧，如有變更，確認(rèn)是否需要進(jìn)行再驗(yàn)證和如何進(jìn)行再驗(yàn)證為什么要進(jìn)行方法驗(yàn)證？方法驗(yàn)證的意義

藥品的生產(chǎn)過程中，原料、中間體、成品均需進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果既是過程受控的依據(jù)，也是評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量的重要依據(jù)，檢驗(yàn)結(jié)果應(yīng)準(zhǔn)確可靠。而分析方法的驗(yàn)證為檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性及可靠性提供了可靠保證。

※方法驗(yàn)證可以分成兩種類型：

1）藥典或注冊(cè)分析方法的驗(yàn)證2）非藥典或注冊(cè)分析方法的驗(yàn)證

（一般為企業(yè)針對(duì)自身的產(chǎn)品而自行開發(fā)的方法）檢測(cè)方法驗(yàn)證與確認(rèn)方法驗(yàn)證（Verification）通過提供客觀證據(jù)對(duì)規(guī)定要求已得滿足的認(rèn)定。方法確認(rèn)（Validation）

通過檢查并提供客觀證據(jù)以證實(shí)某一特定預(yù)期用途的特定要求得到滿足。確認(rèn)是對(duì)驗(yàn)證的結(jié)果評(píng)價(jià)；驗(yàn)證注重“過程”，確認(rèn)注重“結(jié)果”相關(guān)法規(guī)ICH

（用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì)）相關(guān)法規(guī)

ICHQ2（R1）、Q2A、Q2B藥典

各國藥典對(duì)分析方法驗(yàn)證均有具體的規(guī)定。2010版《中國藥典》附錄XIXA藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則USP<1225>ValidationofcompendiamethodsFDA相關(guān)法規(guī)

《色譜方法驗(yàn)證審評(píng)指南驗(yàn)證》方法開發(fā)和方法驗(yàn)證的關(guān)系方法開發(fā)是實(shí)現(xiàn)方法驗(yàn)證的先行步驟

方法驗(yàn)證是檢驗(yàn)方法開發(fā)是否成功的依據(jù)

方法開發(fā)階段仍需要進(jìn)行部分的方法驗(yàn)證的內(nèi)容

-如：考察保留時(shí)間的重現(xiàn)性方法開發(fā)與方法驗(yàn)證的關(guān)系圖

方法開發(fā)方法驗(yàn)證方法適用方法不適用驗(yàn)證不通過驗(yàn)證通過重新進(jìn)行方法開發(fā)，并檢討方法開發(fā)流程確定為SOP方法驗(yàn)證的前提條件儀器：儀器設(shè)備經(jīng)過驗(yàn)證和校正，且在有效期內(nèi)人員：經(jīng)過充分的培訓(xùn)，熟悉方法以及所使用的儀器物料：使用符合相關(guān)規(guī)定的物料（包括標(biāo)準(zhǔn)品、試劑、容器等）方法：該分析方法的開發(fā)和優(yōu)化已經(jīng)成功完成，并且已經(jīng)考察其耐用性。環(huán)境：試驗(yàn)環(huán)境符合該分析方法的要求。（潔凈度、溫度、濕度等）方法驗(yàn)證計(jì)劃如何制定？方法驗(yàn)證的技術(shù)要素準(zhǔn)確度（回收率）精密度專屬性檢測(cè)限定量限線性范圍耐用性

不同的分析方法對(duì)驗(yàn)證項(xiàng)目的要求：驗(yàn)證項(xiàng)目鑒別雜質(zhì)定性雜質(zhì)定量測(cè)定含量溶出度等準(zhǔn)確度--+++精密度—重復(fù)性--+++精密度—中間精密度--+++專屬性+++++檢測(cè)限-+---定量限--+--線性--+++范圍--+++耐用性+++++擬定驗(yàn)證計(jì)劃根據(jù)分析方法確定驗(yàn)證項(xiàng)目明確各驗(yàn)證項(xiàng)目需要進(jìn)行何種實(shí)驗(yàn)明確各驗(yàn)證項(xiàng)目負(fù)責(zé)人的責(zé)任確定各驗(yàn)證項(xiàng)目的完成期限匯總成驗(yàn)證計(jì)劃，請(qǐng)質(zhì)量負(fù)責(zé)人或者檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人審核批準(zhǔn)驗(yàn)證計(jì)劃批準(zhǔn)生效，須制成正式文件存檔備查，同時(shí)正式開始方法驗(yàn)證

準(zhǔn)確度（Accuracy）準(zhǔn)確度，是指用該方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度；表示分析方法的正確性。由于“真實(shí)值”無法準(zhǔn)確知道，因此，通常采用回收率（%）來表示。涉及到定量測(cè)定的檢測(cè)項(xiàng)目均需驗(yàn)證準(zhǔn)確度，如雜質(zhì)定量檢查，含量和溶出方法，分析方法的準(zhǔn)確度能夠確保：

1）樣品中的待測(cè)物全部溶解2）待測(cè)物全部從檢測(cè)器中檢出如何進(jìn)行準(zhǔn)確度的驗(yàn)證？準(zhǔn)確度的測(cè)定至少選取包括標(biāo)準(zhǔn)濃度在內(nèi)的至少3個(gè)濃度級(jí)別（通常選取80%、100%和120%），每個(gè)濃度級(jí)別至少測(cè)定3次，計(jì)算測(cè)定結(jié)果的回收率。

1）原料藥

a）用已知純度的對(duì)照品或符合要求的原料藥進(jìn)行測(cè)定；

b）用所得結(jié)果與已通過驗(yàn)證的另一方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較。2）制劑a）用含有已知量被測(cè)物的各組分混合物進(jìn)行測(cè)定；b）如無法得到制劑的全部組分，可采用加樣回收試驗(yàn)法；

c）用所得結(jié)果與已通過驗(yàn)證的另一方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較。

3）雜質(zhì)

a）用已知純度的對(duì)照品或符合要求的原料藥進(jìn)行測(cè)定；

b）用所得結(jié)果與已通過驗(yàn)證的另一方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較。

回收率（Recovery）測(cè)定回收率R的具體方法可采用：“回收試驗(yàn)法”和“加樣回收試驗(yàn)法”回收試驗(yàn)空白+已知量A的對(duì)照品（或標(biāo)準(zhǔn)品）測(cè)定，測(cè)定值為M

加樣回收試驗(yàn)已準(zhǔn)確測(cè)定含量P的真實(shí)樣品+已知量A的對(duì)照品（或標(biāo)準(zhǔn)品）測(cè)定，測(cè)定值為M回收率（Recovery）對(duì)于檢測(cè)的禁用物質(zhì)，回收率應(yīng)在方法測(cè)定低限、兩倍方法測(cè)定低限和十倍方法測(cè)定低限進(jìn)行三水平試驗(yàn)（n=3）；對(duì)于已制定最高殘留量（MRL）的樣品，回收率應(yīng)在方法測(cè)定低限、MRL、選一合適點(diǎn)進(jìn)行三水平試驗(yàn)；在加樣回率收試驗(yàn)中須注意標(biāo)準(zhǔn)品的加入量與樣品被測(cè)組分含有量之和必須在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)；應(yīng)報(bào)告供試品取樣量、供試品中含有量、對(duì)照品加入量、測(cè)定結(jié)果和回收率(％)計(jì)算值，以及回收率(％)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)回收率（Recovery）準(zhǔn)確度的接受標(biāo)準(zhǔn)1）含量和溶出：

a）各濃度下的平均回收率應(yīng)在98.0%-102.0%之間b）9個(gè)回收率數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）應(yīng)不大于2.0%c）中藥檢品一般應(yīng)滿足：回收率計(jì)算值在95%-105%范圍2）雜質(zhì)雜質(zhì)含量水平接受標(biāo)準(zhǔn)≤0.2%絕對(duì)值±0.05%0.2%-1.0%相對(duì)值±20%＞1.0%相對(duì)值±10%指在規(guī)定測(cè)試條件下，同一均勻供試品，經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間接近的程度。用偏差（d）、標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)（變異系數(shù)，CV）表示。精密度（Precision）精密度（Precision）重復(fù)性（Repeatability）在相同的操作條件下，在較短時(shí)間間隔內(nèi)，由同一分析人員測(cè)定結(jié)果的精密度；中間精密度（Intermediateprecision)同一實(shí)驗(yàn)室不同日期、不同儀器不同分析人員對(duì)同一樣品測(cè)定結(jié)果的精密度，重現(xiàn)性（Reproducibility）

在不同實(shí)驗(yàn)室由不同分析人員測(cè)定結(jié)果的精密度。重復(fù)性（Repeatability）是指在同一條件下對(duì)同一批樣品，從樣品液制備開始，制備至少六份以上供試品溶液(即n≥6),或設(shè)計(jì)3

個(gè)不同濃度，每個(gè)濃度各分別制備3份供試溶液，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算其含量的平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。接受標(biāo)準(zhǔn)：原料藥方法驗(yàn)證時(shí)，活性成分的RSD≤1.0%；制劑方法驗(yàn)證時(shí)，活性成分峰RSD≤2.0%；雜質(zhì)方法驗(yàn)證是，每個(gè)雜質(zhì)峰RSD≤20%；中間精密度（IntermediatePrecision）同一批樣品每位分析人員準(zhǔn)備六份進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算兩人之間平均值的差異。

接受標(biāo)準(zhǔn)：原料藥方法驗(yàn)證時(shí)，平行六份樣品的RSD≤1.0%，兩人之間的平均值之差≤1.0%；制劑方法驗(yàn)證時(shí)，平行六份樣品的RSD≤2.0%，兩人之間的平均值之差≤3.0%；雜質(zhì)方法驗(yàn)證是，平行六份樣品的RSD≤20%，兩人之間的平均值之差如下表：雜質(zhì)含量水平接受標(biāo)準(zhǔn)≤0.2%絕對(duì)值±0.05%0.2%-1.0%相對(duì)值±20%＞1.0%相對(duì)值±10%重現(xiàn)性（Reproducibility）是指在不同的實(shí)驗(yàn)室由不同分析人員測(cè)定結(jié)果的精密度。當(dāng)分析方法將被法定標(biāo)準(zhǔn)采用時(shí)，應(yīng)進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn)。如建立藥典分析方法時(shí)，通過協(xié)同檢驗(yàn)得出重現(xiàn)性結(jié)果，協(xié)同檢驗(yàn)及重現(xiàn)性結(jié)果均應(yīng)記載在起草說明中。一般實(shí)驗(yàn)室不進(jìn)行此項(xiàng)考察。準(zhǔn)確度和精密度關(guān)系A(chǔ)

準(zhǔn)確度好，精密度好B

準(zhǔn)確度差，精密度好C

準(zhǔn)確度好，精密度差D

準(zhǔn)確度差，精密度差指在其他成分（如雜質(zhì)、降解物、輔料等）可能存在下，采用的分析方法能夠正確鑒定、檢出被分析物質(zhì)的特性通常，鑒別、雜質(zhì)檢查、含量測(cè)定方法中均應(yīng)考察其專屬性。如果采用的方法專屬性欠佳，應(yīng)采用多個(gè)方法予以補(bǔ)充。專屬性（

Specificity

）應(yīng)當(dāng)證明潛在的干擾成分不會(huì)對(duì)方法的性能產(chǎn)生負(fù)作用。對(duì)于色譜方法，要求證實(shí)雜質(zhì)之間、雜質(zhì)與主峰之間的選擇性；分離度≥1.5，如果有充分的證據(jù)證明確實(shí)可行，某些情況下分離度低于1.2也可以接受?？瞻讓?duì)照應(yīng)無干擾。專屬性的接受標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)限（limitofdetection，LOD）

檢測(cè)限，是指試樣中被測(cè)物能被檢測(cè)出的最低量。檢測(cè)限是一種限度檢驗(yàn)效能指標(biāo)，即反映方法與儀器的靈敏度和噪音的大小，也表明樣品經(jīng)處理后空白(本底)值的高低?？捎靡阎蜐舛葮悠窚y(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，計(jì)算出能被可靠地檢測(cè)出的最低濃度或量。一般以S/N＝3時(shí)的相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定檢測(cè)限。檢測(cè)限的報(bào)告數(shù)據(jù)應(yīng)附圖譜，說明測(cè)試過程和檢測(cè)限結(jié)果。

定量限（1imitofquantitation，LOQ）定量限，是指在保證一定準(zhǔn)確度和精密度的前提下，樣品中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量。常用信噪比法測(cè)定定量限。一般以S/N＝10時(shí)相應(yīng)的濃度或注入儀器的量進(jìn)行確定。也可用儀器所測(cè)空白背景響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)差（SD）的10倍為估計(jì)值，再經(jīng)試驗(yàn)確定。應(yīng)附典型圖譜線性（linearity）線性，在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，測(cè)試結(jié)果與試樣中被測(cè)物質(zhì)濃度呈線性關(guān)系的程度。線性是定量測(cè)定的基礎(chǔ)，涉及定量測(cè)定的項(xiàng)目，均需要驗(yàn)證其線性。應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)測(cè)定線性關(guān)系?？捎靡毁A備液經(jīng)精密稀釋，制備一系列供試品的方法進(jìn)行測(cè)定，至少制備5個(gè)濃度（通常選擇50%、80%、100%、120%、150%）。以測(cè)得的響應(yīng)信號(hào)對(duì)被測(cè)物濃度作圖，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸。回歸方程的相關(guān)系數(shù)r

越接近于1，表明線性關(guān)系越好。必要時(shí)，響應(yīng)信號(hào)可經(jīng)數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換，再進(jìn)行線性回歸計(jì)算，并說明依據(jù)。線性數(shù)據(jù)要求回歸方程；相關(guān)系數(shù)R是相關(guān)系數(shù)（correlationcoefficient）表示說兩個(gè)變量變化的共同趨勢(shì)有多少；R2稱為確定系數(shù)（determinationcoefficient）意思是一個(gè)變量的變化有百分之多少可以由另一個(gè)變量來解釋。兩者都是用于檢驗(yàn)的，但前者是用于檢驗(yàn)兩變量間線性相關(guān)程度，后者用于檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臄M合效果，這個(gè)模型不一定是y=bx+a型的。線性圖線性的接受標(biāo)準(zhǔn)含量類型相關(guān)系數(shù)截距含量方法R≥0.9997，或R2≥0.999≤2.0%定量雜質(zhì)方法R≥0.995，或R2≥0.990≤20%范圍范圍指能達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性，測(cè)試方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間。雜質(zhì)定量檢查、含量和溶出方法均應(yīng)驗(yàn)證其范圍，分析方法的范圍應(yīng)根據(jù)具體分析方法以及對(duì)線性、準(zhǔn)確度、精密度的結(jié)果和要求確定。范圍通常用于分析方法測(cè)試結(jié)果相同的單位（如百分濃度）表達(dá)。涉及到定量測(cè)定的檢測(cè)項(xiàng)目均需要對(duì)范圍進(jìn)行驗(yàn)證，如含量測(cè)