核酸分子雜交

核酸分子雜交第1頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月一、概念：1、分子雜交（hybridization):有一定同源性的兩條核酸單鏈，在適宜的溫度和離子濃度等條件下，通過堿基互補退火形成穩(wěn)定的雙鏈分子的過程。2、

印跡（bloting）：將DNA、RNA或蛋白質(zhì)固定到固體支持物上的過程。3、探針（probe）：核酸探針是指用放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)標(biāo)記的，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補的已知DNA或RNA片段。第2頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月4、種類：固相雜交（solid-phasehybridization）是將變性的DNA固定于固體基質(zhì)（硝酸纖維素膜或尼龍濾膜）上，再與探針進行雜交，故也稱為膜上印跡雜交。液相雜交（solutionhbridization）指使變性的待測核酸單鏈與已知的核酸單鏈（探針）在溶液中保溫，使之形成雜交復(fù)合物。DNA與DNA雜交DNA與RNA雜交RNA與RNA雜交第3頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月5、幾種常見的雜交：分子雜交是通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性標(biāo)記的探針與被固定的分子雜交，經(jīng)顯影后顯示出目的DNA或RNA分子所處的位置。根據(jù)被測定的對象，分子雜交基本可分為以下幾大類：

(1)Southern雜交：DNA片段經(jīng)電泳分離后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，然后與探針雜交。被檢對象為DNA，探針為DNA或RNA。

(2)Northern雜交：RNA片段經(jīng)電泳后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上或尼龍膜，然后用探針雜交。被檢對象為RNA,探針為DNA或RNA。第4頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月二、Southern雜交1、步驟：

Southern雜交可用來檢測經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后的DNA片段中是否存在與探針同源的序列，它包括下列步驟:

(1)酶切DNA,凝膠電泳分離各酶切片段,然后使DNA原位變性。

(2)將DNA片段轉(zhuǎn)移到固體支持物(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上。

(3)預(yù)雜交濾膜,掩蓋濾膜上非特異性位點。

(4)讓探針與同源DNA片段雜交，然后漂洗除去非特異性結(jié)合的探針。

(5)通過顯影檢查目的DNA所在的位置。

第5頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

Southern雜交能否檢出雜交信號取決于很多因素，包括目的DNA在總DNA中所占的比例、探針的大小和比活性、轉(zhuǎn)移到濾膜上的DNA量以及探針與目的DNA間的配對情況等。在最佳條件下，放射自顯影曝光數(shù)天后,Southern雜交能很靈敏地檢測出低于0.1pg與32P標(biāo)記的高比活性探針的(>109cpm/μg)互補DNA。如果將10μg基因組DNA轉(zhuǎn)移到濾膜上，并與長度為幾百個核苷酸的探針雜交，曝光過夜，則可檢測出哺乳動物基因組中1kb大小的單拷貝序列。第6頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2、固體支持物的種類：帶正電荷的尼龍膜、硝酸纖維膜、PVDF膜尼龍膜是較理想的核酸固相支持物，有多種類型；硝酸纖維素膜是目前應(yīng)用最廣的一種固相支持物，價格最便宜；PVDF膜介于二者之間。

尼龍膜結(jié)合DNA和RNA能力可達480－600μg/cm2，可結(jié)合短至10bp的核酸片段；硝酸纖維素膜結(jié)合DNA和RNA能力可達80－100μg/cm2，對于200bp的核酸片段結(jié)合不強；PVDF膜結(jié)合DNA和RNA能力可達125－300μg/cm2。第7頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月尼龍膜經(jīng)烘烤或紫外線照射后，核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的正電荷結(jié)合；硝酸纖維素膜依靠疏水性相互作用結(jié)合DNA，結(jié)合不牢固；PVDF膜結(jié)合牢固，耐高溫，特別適合于蛋白印跡。

就韌性而言：尼龍膜較強；硝酸纖維素膜較脆，易破碎；PVDF膜較強。

就重復(fù)性而言：尼龍膜可反復(fù)用于分子雜交，雜交后，探針分子可經(jīng)堿變性被洗脫下來；硝酸纖維素膜不能重復(fù)使用；PVDF膜可以重復(fù)使用。第8頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月3、轉(zhuǎn)膜的方式：將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移到固體支持物上的方法主要有3種:(1)毛細管轉(zhuǎn)移。本方法由Southern發(fā)明，故又稱為Southern轉(zhuǎn)移(或印跡)。毛細管轉(zhuǎn)移方法的優(yōu)點是簡單,不需要用其他儀器。缺點是轉(zhuǎn)移時間較長,轉(zhuǎn)移后雜交信號較弱。(2)電泳轉(zhuǎn)移。將DNA變性后,可電泳轉(zhuǎn)移至帶電荷的尼龍膜上。該法的優(yōu)點是不需要脫嘌呤/水解作用，可直接轉(zhuǎn)移較大的DNA片段。缺點是轉(zhuǎn)移中電流較大，溫度難以控制。通常只有當(dāng)毛細管轉(zhuǎn)移和真空轉(zhuǎn)移無效時，才采用電泳轉(zhuǎn)移。第9頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月(3)真空轉(zhuǎn)移。有多種真空轉(zhuǎn)移的商品化儀器,它們一般是將硝酸纖維素膜或尼龍膜放在真空室上面的多孔屏上，再將凝膠置于濾膜上，緩沖液從上面的一個貯液槽中流下，洗脫出凝膠中的DNA,使其沉積在濾膜上。該法的優(yōu)點是快速，在30分鐘內(nèi)就能從正常厚度(4-5mm)和正常瓊脂糖濃度(<1%)的凝膠中定量地轉(zhuǎn)移出來。轉(zhuǎn)移后得到的雜交信號比Southern轉(zhuǎn)移強2-3倍。缺點是如不小心，會使凝膠碎裂，并且在洗膜不嚴(yán)格時，其背景比毛細轉(zhuǎn)移要高。第10頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月第11頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月第12頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月第13頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月4、毛細管轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜用的溶液：（1）高鹽溶液：1.5MNaCl（2）0.4NNaOH如果DNA分子大，可以用0.25NHCL處理或用紫外線處理，將DNA分子適當(dāng)打斷，以提高轉(zhuǎn)移的效果，注意處理的時間適度??！第14頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月5、轉(zhuǎn)膜后DNA的固定方式：轉(zhuǎn)膜后，膜用2×SSC漂洗，然后固定：（1）80℃干烤0.5-2小時；（2）254nm波長的紫外線照射尼龍膜帶RNA的一面。后一種方法較為繁瑣,但卻優(yōu)先使用,因為某些批號的帶正電荷的尼龍膜經(jīng)此處理后,雜交信號可以增強。然而為獲得最佳效果,務(wù)必確保尼龍膜不被過度照射，適度照射可促進DNA上小部分堿基與尼龍膜表面帶正電荷的胺基形成交聯(lián)結(jié)構(gòu),而過度照射卻使DNA上一部分胸腺嘧啶共價結(jié)合于尼龍膜表面,導(dǎo)致雜交信號減弱。第15頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月三、Northern雜交

Northern雜交與Southern雜交很相似。主要區(qū)別是被檢測對象為RNA,其電泳在變性條件下進行,以去除RNA中的二級結(jié)構(gòu),保證RNA完全按分子大小分離。變性電泳主要有2種:乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳。電泳后的瓊脂糖凝膠用與Southern轉(zhuǎn)移相同的方法將RNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上,然后與探針雜交。注意：（1）RNA對堿性敏感，不能用NaOH溶液作為轉(zhuǎn)膜夜。如果瓊脂糖濃度高于1%，或凝膠厚度大于0.5cm，或待分析的RNA大于2.5kb,需用0.05mol/LNaOH浸泡凝膠20分鐘,部分水解RNA并提高轉(zhuǎn)移效率。浸泡后用經(jīng)DEPC處理的水淋洗凝膠,并用20×SSC浸泡凝膠45分鐘。然后再轉(zhuǎn)移到濾膜上。第16頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）含甲醛的凝膠在RNA轉(zhuǎn)移前需用經(jīng)DEPC處理的水淋洗數(shù)次,以除去甲醛。（3）尼龍膜的不足之處是背景較高,用RNA探針時尤為嚴(yán)重。將濾膜長時間置于高濃度的堿性溶液中,會導(dǎo)致雜交背景明顯升高,可通過提高預(yù)雜交和雜交步驟中有關(guān)阻斷試劑的量來予以解決。第17頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月四、菌落原位雜交

對分散在若干個瓊脂平板上的少數(shù)菌落（100-200）進行克隆篩選時，可采用本方法。將這些菌落歸并到一個瓊脂主平板以及已置于第二個瓊脂平板表面的一張尼龍膜上。經(jīng)培養(yǎng)一段時間后，對菌落進行原位裂解。主平板應(yīng)貯存于4℃直至得到篩選結(jié)果。

第18頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月五、斑點雜交

斑點雜交是指將DNA或RNA樣品直接點在硝酸纖維素濾膜上,然后與核酸探針分子雜交，以顯示樣品中是否存在特異的DNA或RNA。同一種樣品經(jīng)不同倍數(shù)的稀釋,還可以得到半定量的結(jié)果。所以它是一種簡便、快速、經(jīng)濟的分析DNA或RNA的方法,在基因分析和基因診斷中經(jīng)常用到,是研究基因表達的有力工具。但由于目的序列未與非目的序列分離,不能了解目的序列的長度。尤其當(dāng)本底干擾較高時,難以區(qū)分目的序列信號和干擾信號。 第19頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月六、影響雜交的因素

1、溫度雜交技術(shù)最重要的因素之一是選擇最適的雜交反應(yīng)溫度。若反應(yīng)溫度低于Tm10～15℃，堿基順序高度同源的互補鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯配對減少。若反應(yīng)溫度再低（Tm-30℃），雖然互補鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補堿基配對減少，錯配對增多、氫鍵結(jié)合的更弱。如兩個同源性在50%左右或更低些的DNA，調(diào)整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10倍，因此在實驗前必須首先確定雜交溫度。

第20頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月通常有三種溫度可供試驗，即最適復(fù)性溫度、苛刻復(fù)性溫度及非苛刻復(fù)性溫度。溫度的選擇及溫度對雜交的影響見下表。最適復(fù)性溫度（Optimunmrenaturationtemperature,TOR）：Tor=Tm–25℃苛刻復(fù)性溫度：Ts=Tm–(10或15℃)非苛刻復(fù)性溫度：Tns=Tm–(30或35℃)在2×SSC反應(yīng)液中，可以根據(jù)下列公式計算最適復(fù)性溫度：TOr=0.51(G+C%)+47℃。第21頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月DNAG+C%雜交反應(yīng)溫度（℃）

TorTsTns3062.373.352.33564.974.954.94067.477.457.44570.080.060.05072.582.562.55575.185.165.1DNA—DNA雜交溫度的選擇范圍（2×SSC）

第22頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月如果綜合考慮：EffectiveTm＝81.5+16.6(logM[Na+])+0.41(%G+C)–0.72(%formamide)根據(jù)所用的雜交溶液確定雜交的溫度：一般來說，雜交相為水溶液時,則在65℃雜交，而在50%甲酰胺溶液中時,則在42℃下雜交。2、

離子強度離子強度增加，Tm值增加，一般用0.9-0.75mol/L的NaCl3、DNA的濃度最低檢測水平為單拷貝為：0.5pg第23頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月4、探針的濃度：總的來說，隨探針濃度增加，雜交率也增加。另外，在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加。要獲得較滿意的敏感性，膜雜交中32P標(biāo)記探針與非放射性標(biāo)記探針的用量分別為5～10ng/ml和25～1000ng/ml

探針質(zhì)量衡量的指標(biāo)：比活性即cpm/μg

如果比活性為108cpm/μg，用的濃度為10μg/ml，比活性為109cpm/μg，用的濃度為2μg/ml。第24頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月5、探針的長度和同源性：為了保證雜交的特意性，一般需要用500pb左右的長度的探針。但是，探針過量的條件下，雜交率主要依賴于探針長度（復(fù)雜度）和探針濃度。在濃度一定時，雜交率主要影響因素是探針的長度，長的探針雜交時間很長，而短探針容易退火，因此標(biāo)記好的探針長度為100nt左右，太短將探針與目的序列的結(jié)合。第25頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月探針與被檢測的DNA之間的同源性也影響Tm：

1%mismatchoftwoDNAlowerstheTm1.4℃

如果雜交溫度為67.5℃，要求DNA間的同源性為87.5%，在65℃、5xSSC的條件下，要求探針與被檢測的DNA之間的同源性為多少？假設(shè)：％（G＋C）＝45％

Tm＝81.5+16.6(log0.825)+0.41(45%)=98.6℃

同源性＝100－{(98.6－65.0)/1.4}=83.1%第26頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月6、雜交液的成分：反應(yīng)液中每增加1%的甲酰胺濃度，tm值可降低0.72℃。6M尿素，降低Tm約30℃惰性多聚體可用來促進250個堿基以上的探針的雜交率。對單鏈探針可增加3倍，而對雙鏈探針、隨機剪切或隨機引物標(biāo)記的探針可增加高達100倍。硫酸葡聚糖是一種廣泛用于較長雙鏈探針雜交的促進劑。這是一種多聚胺，平均分子量為500000。另一種常見的促進劑是聚乙二醇（PEG），PEG分子量小（6000～8000）、粘度低、價格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些條件下5%～10%硫酸葡聚糖效果較好，若用5%～10%PEG則可產(chǎn)生很高的本底。因此，使用促進劑時有必要優(yōu)化條件。第27頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月選用不同的封閉試劑：如Denhardt‘s試劑、肝素或一種由5%脫脂奶粉組成的BLOTTO或blockreagent,這些試劑中需加入斷裂的鮭魚精子DNA或酵母DNA，并和SDS一起使用。與Denhardt's試劑相比,BLOTTO價格便宜,使用方便,同樣可獲得滿意的結(jié)果，但它不能用于RNA雜交。一般而言,尼龍膜用Denhardt's試劑比用BLOTTO能得到更高的信噪比。第28頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月7、雜交的時間在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時間。時間短了，雜交反應(yīng)不完成；時間長了也無益，會引起非特異結(jié)合增多。一般雜交反應(yīng)要進行16h左右。8、雜交液的體積：一般來說使用較小體積的雜交液比較好，因為在小體積溶液中，核酸重新配對的速度快、探針用量少，從而使濾膜上的DNA在反應(yīng)中起主要作用。但在雜交中必須保證有足夠的雜交溶液覆蓋雜交膜。一般雜交液的用量為1ml/10cm2

第29頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月七、洗膜時應(yīng)注意的事項1、洗膜的溫度和SSC的濃度：

Stringency:atermusedinhybridizationexperimentstodenotethedegreeofhomologybetweentheprobeandthefilterboundnucleicacid,thehigherthestringency,thehigherpercenthomologybetweentheprobeandthefilterboundnucleicacid.（1）Non-stringentwash:2xSSC,65℃EffectiveTm＝81.5+16.6(log0.33)＋0.41(45%)＝92.2℃％homology＝100－[（92－65）/1.4]＝80.7%（2）Stringentwash:0.1xSSC，65℃EffectiveTm＝81.5+16.6(log0.0165)＋0.41(45%)＝70.4℃％homology＝100－[（70.4－65）/1.4]＝96.1%第30頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2、洗膜的時間與次數(shù)：一般用2XSSC洗1－2次，然后用嚴(yán)格的洗液洗2次，每次30分鐘。第31頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月八、脫探針的方法及注意事項：尼龍膜可以重復(fù)利用，因此雜交后不能干燥，一定保持濕潤。處理方法：0.1XSCC/0.1%SDS、100℃5－10分鐘

DNA的膜還可以用0.2NNaOH處理第32頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月九、標(biāo)記的方法1、缺口平移法（NickTranslation）原理及過程：反應(yīng)體系中DNA酶I隨機在探針DNA上打開缺口，然后利用DNA聚合酶I5’→3’外切酶活性，在缺口處按5’→3’方向切除單核苷酸；同時DNA聚合酶I有5’→3’的聚合酶活性，在缺口處3’端加入底物中的單核苷酸，彌補缺口處的核苷酸鏈。隨著反應(yīng)的進行底物中被標(biāo)記單核苷酸，并被隨機摻入。DNA聚合酶I的兩種作用交替進行，探針即被標(biāo)記。第33頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月第34頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2、隨機引物法（6核苷酸引物標(biāo)記法）原理及過程：利用E.coliDNA聚合酶I的Klenow亞單位，合成含有標(biāo)記核苷酸的DNA鏈。Klenow具有5’→3’聚合酶活性。被標(biāo)記的DNA（探針）變性成單鏈，引物與模板結(jié)合。在Klenow的催化下，以引物3’端為起點，沿模板3’→5’方向合成DNA新鏈。反應(yīng)體系中含有標(biāo)記的dNTP,隨機摻入新合成的DNA鏈中，探針即被標(biāo)記。第35頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月第36頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月3、末端標(biāo)記第37頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）交換反應(yīng)標(biāo)記法第38頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月十、標(biāo)記的種類理想的標(biāo)記物：

①具有高度的靈敏性②與探針結(jié)合后，不影響雜交及探針的主要理化特性③檢測方法高靈敏性、高特異性，假陽性率低，環(huán)境污染少，價格低廉；④若用酶促方法標(biāo)記，應(yīng)對Km影響不大第39頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月1、同位素[α-32P]dNTP、[α-32S]dNTP用缺口平移法和隨機引物法γ-32P-ATP用于末端標(biāo)記放射性同位素（radiosotlope）是不穩(wěn)定的，它會“變”。放射性同位素的原子核很不穩(wěn)定，會不間斷地、自發(fā)地放射出射線，直至變成另一種穩(wěn)定同位素，這就是所謂“核衰變”。放射性同位素衰變的快慢，通常用“半衰期”來表示。半衰期（half-life）即一定數(shù)量放射性同位素原子數(shù)目減少到其初始值一半時所需要的時間。第40頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月同位素的特性：①檢測特異性強；②靈敏度高；③對酶促反應(yīng)無任何影響，也不影響堿基配對的特異性和穩(wěn)定性；④易造成放射性污染；⑤半衰期短的同位素應(yīng)用受到限制，隨用隨標(biāo)記，立即使用，不能長時間存放。第41頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月同位素符號半衰期β射線能量（MeV）氫-33H12.3年0.018碳-1414C5720年0.156磷－3232P14.3天1.71硫－3535S87.1天0.167碘－131131I8.05天0.605常用同位素的特征第42頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月第43頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2、非放射性標(biāo)記優(yōu)點：無環(huán)境污染，可較長時間貯存方法：1.酶標(biāo)記法

2.化學(xué)標(biāo)記法要求：標(biāo)記物應(yīng)具有耐熱、對組織細胞無特異親和性、分子量小，對探針雜交無影響或影響甚小，不影響DNA三維空間構(gòu)象的形成。常用的標(biāo)記物：生物素（biotin）、地高辛（digoxigenin）、光生物素（photobiotin）、補骨脂素、2-乙酰氨基芴（2-acetylominofluorene）第44頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月地高辛（Digoxigenin簡寫Digo-）又稱異羥基洋地黃毒甙配基，這種類固醇半抗原僅限于洋地黃類植物，其抗體與其它任何固醇類似物如人體中的性激素等無交叉反應(yīng)，地高辛配基標(biāo)記于脫氧尿嘧啶三磷酸核苷（dUTP）上形成digoxigenin–11-dUTP第45頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月地高辛標(biāo)記技術(shù)源于一種從洋地黃類植物（毛地黃和毛花毛地黃）中提取的類固醇（Steroid）物質(zhì)——Digoxigenin（DIG），在醫(yī)學(xué)上可用于治療各種急性和慢性心功能不全以及室上性心動過速、心房顫動和撲動等疾病。由于洋地黃植物的花和葉片Digoxigenin在自然界中的唯一來源，因此抗DIG的抗體不會與其他的生物物質(zhì)結(jié)合，從而可以滿足特異性標(biāo)記的需要。這一點，正是DIG勝于生物素(Biotin)的地方——同樣是小分子標(biāo)記物，生物素廣泛存在于各種組織中，對于靈敏度很高的標(biāo)記檢測實驗來說，樣品自身含有的內(nèi)源生物素，就會對結(jié)果產(chǎn)生干擾。地高辛就能夠很好地避免這個問題。第46頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月通過隨機引物或缺口翻譯法（多用隨機引物法），將dig-11-dUTP與探針的核酸分子相連，構(gòu)成Dig-配基標(biāo)記的核酸探針。將這種標(biāo)記的探針與核酸分子之間的同源序列在一定條件下互補雜交，然后用偶聯(lián)有酶或熒光素的羊抗高地辛抗體Tab（抗原結(jié)合片段