濕地松胚性愈傷組織增殖的影響因素分析

濕地松胚性愈傷組織增殖的影響因素分析

濕地松是柏樹科的一種速生樹種，屬于裸露的松科（pinaceae），在20世紀(jì)30年代引入中國(guó)。培養(yǎng)基的pH會(huì)影響培養(yǎng)基中外源激素和營(yíng)養(yǎng)元素的作用效果，可能對(duì)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)狀況產(chǎn)生不同的影響本研究以濕地松優(yōu)良無性系的胚性愈傷組織為研究材料，探究了不同pH、碳源和谷氨酰胺及其替代物丙谷二肽對(duì)濕地松胚性愈傷組織增殖的影響，期望能夠獲得適合濕地松胚性愈傷組織增殖的主碳源種類及使用濃度，明確最優(yōu)pH范圍，并回答谷氨酰胺能否被丙谷二肽替代的問題，以進(jìn)一步降低培養(yǎng)成本，促進(jìn)胚性愈傷組織迅速增殖并減輕褐化，為進(jìn)一步提高濕地松胚性愈傷組織增殖的質(zhì)量和數(shù)量奠定研究基礎(chǔ)。1材料和方法1.1合代新品系的誘導(dǎo)獲得胚性愈傷組織2019年6～7月從廣東臺(tái)山紅嶺種子園的濕地松精選種子園（混合代）中，采收優(yōu)良單株自由授粉的未成熟球果，誘導(dǎo)獲得胚性愈傷組織。單種子來源的胚性愈傷組織獨(dú)立建立胚性無性系，從中選擇已繼代6次，增殖能力強(qiáng)，活力好的無性系PEE3-13進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)。1.2測(cè)試方法1.2.1組織特征觀察從誘導(dǎo)的愈傷組織中選取直徑2～5mm大小的愈傷組織材料置于載玻片上，用2%醋酸洋紅和0.5%伊文思藍(lán)先后對(duì)其進(jìn)行染色，在體視顯微鏡下觀察被染色的細(xì)胞團(tuán)特征。鑒定出的胚性愈傷組織用于增殖培養(yǎng)。1.2.2細(xì)胞團(tuán)繼代培養(yǎng)將愈傷組織置于Y0固體培養(yǎng)基表面進(jìn)行繼代增殖，暗培養(yǎng)，23±1℃，每隔14d繼代1次，繼代時(shí)優(yōu)選愈傷塊表面新生的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行繼代，以維持無性系的活力。Y0培養(yǎng)基以mP6為基本培養(yǎng)基1.2.3生物重復(fù)性試驗(yàn)在Y0固體培養(yǎng)基成分不變的情況下，高壓滅菌前用1mol·L將PEE3-13的新生胚性愈傷稱量每個(gè)平板約0.7g，輕輕置于培養(yǎng)基表面，并均勻分成7塊，每塊約0.1g，記錄每個(gè)平板的初始接入質(zhì)量，每個(gè)所設(shè)定pH條件下均接入10板作為10個(gè)生物學(xué)重復(fù)。將平板置于23±1℃，黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)14d后，準(zhǔn)確稱重此時(shí)平板上的胚性愈傷總質(zhì)量并記錄。1.2.4紅塊糖對(duì)胚性愈傷組織增殖的影響以生工生物公司購(gòu)買的蔗糖、麥芽糖及市場(chǎng)購(gòu)買的精制白砂糖、紅塊糖為所測(cè)試的碳源種類，設(shè)置6個(gè)處理：30g·LPEE3-13的胚性愈傷組織的繼代和稱重方法同“1.2.2胚性愈傷組織增殖的最適pH篩選”，培養(yǎng)條件一致。1.2.5丙-谷二肽對(duì)胚性愈傷組織增殖的影響以Sigma公司購(gòu)買的L-谷氨酰胺和廣州樂試生物科技有限公司購(gòu)買的L-丙-谷二肽為所測(cè)試的有機(jī)氮源，設(shè)置4個(gè)處理：(1)不添加任何谷氨酰胺或丙谷二肽，(2)450mg·LPEE3-13的胚性愈傷組織的繼代和稱重方法同“1.2.2胚性愈傷組織增殖的最適pH篩選”，培養(yǎng)條件一致。1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析增殖率（%）=（每板培養(yǎng)14d后的質(zhì)量-每板初始接入的質(zhì)量）/每板初始接入的質(zhì)量×100%(1)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSSStasitics21.0軟件進(jìn)行，使用Turkey法進(jìn)行多重比較并用標(biāo)記字母法表示差異顯著性（不同小寫字母代表在P<0.05水平差異顯著）。2結(jié)果與分析2.1胚頭和胚柄的結(jié)構(gòu)利用濕地松未成熟球果誘導(dǎo)獲得的愈傷組織有兩種類型：胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織。胚性愈傷組織染色后在體視鏡下可見分生組織細(xì)胞團(tuán)組成的胚頭（EC,embryonalmasscells）和胚柄（SC,suspensorcells）結(jié)構(gòu)對(duì)所獲得的無性系PEE3-13的愈傷組織進(jìn)行染色鑒定，體視顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)其具有胚頭及胚柄結(jié)構(gòu)，胚頭細(xì)胞團(tuán)密集，胚柄細(xì)胞呈長(zhǎng)條形，緊隨在胚頭細(xì)胞團(tuán)后（見圖1）。因此，所鑒定的愈傷組織由胚性細(xì)胞組成，為胚性愈傷組織。2.2不同ph對(duì)濕地松培養(yǎng)基的影響對(duì)增殖培養(yǎng)基滅菌前和滅菌后的pH分別進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，滅菌前培養(yǎng)基調(diào)整至某一確定的pH后，在滅菌后仍會(huì)發(fā)生較大變化。當(dāng)滅菌前的pH小于6.0時(shí)，滅菌后的pH升高，滅菌前pH越低，升高越多；當(dāng)滅菌前的pH大于或等于6.0時(shí)，滅菌后的pH降低，滅菌前pH越高，降低越多（見表1）。因此，滅菌前調(diào)整培養(yǎng)基的pH至固定值并不能代表培養(yǎng)時(shí)該培養(yǎng)基的實(shí)際pH。在不同pH條件下，胚性愈傷的培養(yǎng)后質(zhì)量和增殖率有很大差別（見表1）。當(dāng)滅菌前pH調(diào)整為6.0，滅菌后pH變?yōu)?.68時(shí)，胚性愈傷的培養(yǎng)后質(zhì)量和平均增殖率最高，平均增殖率可達(dá)到436.20%，但與滅菌前調(diào)整pH為7.0時(shí)沒有顯著差異，說明培養(yǎng)基實(shí)際pH范圍為5.68～6.28時(shí)，均適宜胚性愈傷組織的生長(zhǎng)。當(dāng)滅菌前pH調(diào)整為4.0，滅菌后pH變?yōu)?.77時(shí)，胚性愈傷的培養(yǎng)后質(zhì)量和平均增殖率最低，此時(shí)培養(yǎng)基凝固困難，呈凝膠流動(dòng)狀。當(dāng)滅菌后pH未落在最適范圍內(nèi)時(shí)，平均增殖率均有所下降，說明胚性愈傷組織在增殖過程中對(duì)pH仍較為敏感。綜上，在培養(yǎng)基滅菌前將pH調(diào)節(jié)至6.0～7.0左右，能夠保證滅菌后pH在最適范圍內(nèi)，最大限度降低pH對(duì)胚性愈傷組織增殖的影響。2.3不同碳源對(duì)濕地松胚性愈傷組織增殖的影響利用市售的精制白砂糖、紅塊糖與試劑公司購(gòu)買的蔗糖和麥芽糖進(jìn)行胚性愈傷組織增殖的比較研究，結(jié)果表明，不同碳源對(duì)濕地松胚性愈傷組織增殖的影響非常顯著（見表2）。增殖培養(yǎng)后質(zhì)量及增殖率均在使用30g·L因此，市售精制白砂糖相比于純蔗糖，更適宜濕地松胚性愈傷組織的增殖，但具體是其中的何種成分促進(jìn)了增殖，還需進(jìn)一步探索；而麥芽糖極不適宜濕地松胚性愈傷組織的增殖，即使?jié)舛忍岣咧?5g·L2.4谷氨酰胺替代谷氨酰胺通過添加谷氨酰胺以及不同濃度的丙谷二肽，觀察丙谷二肽能否替代谷氨酰胺用于胚性愈傷組織的增殖培養(yǎng)，結(jié)果表明，丙谷二肽添加后，即使增加使用濃度，培養(yǎng)后質(zhì)量及增殖率均顯著低于添加谷氨酰胺的處理組（見表3），說明丙谷二肽無法在濕地松胚性愈傷組織的增殖培養(yǎng)中替代谷氨酰胺。未添加谷氨酰胺或丙谷二肽的處理組與添加谷氨酰胺的處理組相比，培養(yǎng)后質(zhì)量及增殖率差異雖然略低，但差異不顯著（見表3）；進(jìn)一步在繼代后觀察到未添加谷氨酰胺或丙谷二肽的處理組的胚性愈傷組織更容易褐化，多次繼代后容易出現(xiàn)增殖困難和死亡，說明谷氨酰胺的缺乏即使在培養(yǎng)當(dāng)代未顯著影響增殖率，仍會(huì)潛移默化地影響胚性愈傷組織的細(xì)胞活力，使細(xì)胞活力降低。3體胚增殖過程胚性愈傷組織的增殖是松樹體細(xì)胞胚胎發(fā)生的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，胚性愈傷組織可在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)，并具有發(fā)育為體細(xì)胞胚胎，萌發(fā)形成體胚幼苗的能力。影響針葉樹胚性愈傷組織的增殖的因素有很多，其中包括碳源成分及濃度、微量元素、激素和瓊脂的濃度、pH等，并且這些因素一直是體胚細(xì)胞胚胎發(fā)生過程研究的重點(diǎn)。2003年，曹新祥等人綜述了植物組織培養(yǎng)中pH變化的有關(guān)問題：培養(yǎng)基的pH能夠影響細(xì)胞的分裂和細(xì)胞增殖，當(dāng)環(huán)境pH高于8時(shí)可啟動(dòng)細(xì)胞的分裂，偏低則抑制細(xì)胞分裂；pH還可影響植物材料的呼吸代謝狀況、激素進(jìn)出胞內(nèi)和作用胚性愈傷組織在增殖時(shí)期，基本上不進(jìn)行光合作用，需要額外添加碳水化合物作為能量。培養(yǎng)基中的碳源通常是由糖類提供。蔗糖是松屬胚性愈傷組織增殖過程中最常用的碳源之一，常規(guī)使用濃度在10～30g·L氮元素對(duì)于植物的生長(zhǎng)發(fā)育是至關(guān)重要的，在針葉樹的體胚生長(zhǎng)發(fā)育過程中，所需的氮全部依賴培養(yǎng)基供給，且有研究