火炬松dreb1基因的克隆及生物信息學(xué)分析

火炬松dreb1基因的克隆及生物信息學(xué)分析

干預(yù)因子dreb（遺傳因素骨髓線）的消息是，結(jié)合下游基因啟動子中的crt-dre元素（c-receivec），它在不依賴aba的信號調(diào)整路徑中發(fā)揮了重要作用。電子克隆(采用電子克隆的方法,結(jié)合火炬松熱脅迫cDNA文庫EST序列的CAP3組裝結(jié)果,以及GO注釋分析,選擇了具有DNA結(jié)合特性、核定位信息、轉(zhuǎn)錄因子活性等特點(diǎn)的一個(gè)Unigene,做進(jìn)一步的分析,包括基因的一般特征以及其編碼蛋白一級、二級、三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測,為后續(xù)該基因的分子功能研究提供一些借鑒。1材料和方法1.1est序列拼接、go釋列及目的序列的選擇利用火炬松熱脅迫cDNA文庫EST序列拼接、GO注釋的結(jié)果,選擇目的序列。1.2火炬松假定為火炬松假設(shè)選擇所得的假定火炬松1.3火炬松的分析利用軟件Antheprot分析火炬松1.4功能或功能預(yù)測ANTHEWIN5.0軟件包含有二級結(jié)構(gòu)預(yù)測功能,預(yù)測方法有:GORI、Gibrat、DoublePredictionMethod(DPM)、Homologue等四種方法,對1.5級結(jié)構(gòu)預(yù)測利用CPHmodel預(yù)測該轉(zhuǎn)錄因子的三維結(jié)構(gòu)。CPHmodel是丹麥理工大學(xué)生物序列分析中心的預(yù)測服務(wù)器提供的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測,其方法是基于同源模建,與SWISS-MODEL相比,它簡單易學(xué),只需要目的序列,沒有高級選項(xiàng),如提交自定義的模板等。將目的序列提交后,可隨即得到結(jié)果,不會出現(xiàn)無搜索結(jié)果的情況2結(jié)果與分析2.1heat1-contig-s1a-119根據(jù)火炬松熱脅迫cDNA文庫EST聚類、拼接及GO注釋的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)HEAT1-Contig-h1a-119(見表1),這條序列具有核定位、轉(zhuǎn)錄因子活性、DNA結(jié)合特性等特點(diǎn),表明該基因可能是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。因此,選擇該序列作為目的序列進(jìn)行下一步的研究。2.2基因編碼和分析HEAT1-Contig-h1a-119序列長1293bp,利用DNAMAN預(yù)測該片段的可能編碼框如圖1,發(fā)現(xiàn)在六種可能的讀碼方式中,Plus3含有完整的閱讀框(ORF),具有起始密碼子ATG和終止密碼子TAA,故該片段為一條全長基因,命名為該基因的序列和編碼框如圖2。1基因編碼295個(gè)氨基酸,分子量為32.4kD,等電點(diǎn)pI為8.22。編碼的氨基酸序列中(圖2),絲氨酸含量最高,達(dá)13.9%,Leu含量其次(為12.88%),Ala和Gln含量居第三(8.81%),含量最低的是Trp(1.02%),進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)非極性(疏水)氨基酸含量為39.0%,極性(親水)氨基酸含量為61.0%,極性(親水)氨基酸含量明顯高于非極性的,由此可見,所編碼的蛋白為親水性蛋白。另外,Blast結(jié)果表明,2.3轉(zhuǎn)錄因子分析Antheprot預(yù)測PteaDREB1中的信號肽序列,如圖5所示,發(fā)現(xiàn)N端83～87處ARAQP片段為潛在的信號肽斷裂位點(diǎn)。另外,丹麥理工大學(xué)生物序列分析中心的預(yù)測軟件SingalIP預(yù)測結(jié)果也與Antheprot分析結(jié)果一致。N端信號肽的存在,對于PteaDREB1作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子是必要的。結(jié)構(gòu)位點(diǎn)(Prosite)分析結(jié)果顯示PsG6PDH中存在9種結(jié)構(gòu)位點(diǎn):6個(gè)N-糖基化位點(diǎn),1個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn),5個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn),5個(gè)N-十四?；稽c(diǎn),1個(gè)信號肽酶位點(diǎn),6個(gè)膜脂蛋白脂附著位點(diǎn),1個(gè)半胱氨酸蛋白酶活性位點(diǎn),1個(gè)MYC類型bHLH結(jié)構(gòu)域和2個(gè)Myb類型DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。信號肽酶位點(diǎn)、bHLH結(jié)構(gòu)域和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的存在,為PteaDREB1屬于轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)一步提供了證據(jù)。另外,蛋白激酶位點(diǎn),表明PteaDREB1行使生理生化功能前或者與其他蛋白互作時(shí)可能需要磷酸化的活化。2.4轉(zhuǎn)錄因子pteareb1的二級結(jié)構(gòu)及預(yù)測結(jié)果在Antheprot軟件菜單中選擇methods/Secondarystructureprediction選項(xiàng),采用GOR、Gibrat、Homologue、DPM等4種算法預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子PteaDREB1的二級結(jié)構(gòu),不同方法預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)不盡相同。4種預(yù)測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,α螺旋的比例均在35%～55%,而β折疊均在20%以下,轉(zhuǎn)角的比例也相對較小,在20%以下。其中Gibrat方法預(yù)測的結(jié)果雖沒有轉(zhuǎn)角,但α螺旋的比例較高,可達(dá)55%。2.5同源結(jié)構(gòu)模擬搜索結(jié)果顯示,PteaDREB1的氨基酸105～165部分與擬南芥CBF1中的AP2(PDB編號1GCC)高度相似,同源性達(dá)66.7%。根據(jù)同源建模原理,只要目標(biāo)蛋白與模板蛋白的同源性大于30%,即可進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)的同源模建。因此,對PteaDREB1的氨基酸105～165部分進(jìn)行同源結(jié)構(gòu)模擬,模擬結(jié)果如圖6,N和C端附近分別形成β折疊區(qū)和α螺旋區(qū),β折疊區(qū)有3個(gè)β折疊,α螺旋區(qū)有5個(gè)α螺旋。這是典型的AP2結(jié)構(gòu)域。3在部分品種內(nèi)分離近年來,隨著基因組計(jì)劃和功能基因組以及蛋白組學(xué)的不斷發(fā)展,在世界三大數(shù)據(jù)庫(NCBI,EBI,DDBJ)中登記的數(shù)據(jù)越來越多,但分離和克隆新基因仍是當(dāng)前分子生物學(xué)的重點(diǎn),而且是研究基因結(jié)構(gòu)、功能以及表達(dá)調(diào)控的基礎(chǔ)。分離和克隆基因的經(jīng)典方法是差減雜交、mRNA差異顯示(DDRT)或cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE),這些方法雖然曾成功運(yùn)用于一些基因的分離,但費(fèi)時(shí)費(fèi)力、費(fèi)用高、成功率低,而且在當(dāng)今海量的數(shù)據(jù)里,難以得到廣泛運(yùn)用。電子克隆是在基因組計(jì)劃和EST計(jì)劃基礎(chǔ)上發(fā)展起來的基因克隆新方法,具有成本低、速度快、技術(shù)要求低和針對性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。目前松樹EST數(shù)據(jù)非常豐富,而且EST數(shù)目每天還在高速增加,利用電子克隆分離松樹基因已經(jīng)成為可能,并將極大加速松樹新基因的發(fā)現(xiàn)和功能鑒定研究?；鹁嫠墒鞘澜缒戏剿芍蟹植甲顝V、生長面積最大、木材年產(chǎn)量最高和蓄積量最大的綠化、造林用速生樹種,也被我國廣泛引種,但其耐熱性較差,嚴(yán)重限制其在南方尤其是廣東和海南的推廣范圍。目前,利用常規(guī)育種手段培養(yǎng)耐熱性火炬松新品種未見有成功報(bào)道,究其原因,可能是常規(guī)育種技術(shù)定向改良或培育高抗性林木難度比較大,而且時(shí)間長。但隨著植物基因工程技術(shù)的不斷成熟和完善,已為林木抗逆性改良提供了一個(gè)新途徑。而可用林木遺傳轉(zhuǎn)化的外源基因的匱乏,是這些年林木基因工程發(fā)展緩慢的一個(gè)原因,因此,極有必要