大花蔥愈傷組織誘導(dǎo)分化及再生體系的建立

大花蔥愈傷組織誘導(dǎo)分化及再生體系的建立

大花洋蔥也被稱為江西花。它是百合科的多年生球根花。它的根和莖是嚴(yán)肅的，帶有洋蔥的味道。大花蔥原產(chǎn)亞洲中部，在世界各國園林綠化中多有種植，主要用于花境、巖石園或草坪旁的裝飾和美化，是同屬植物中觀賞價(jià)值較高的一種。目前，我國大花蔥的某些新優(yōu)品種的種球主要依賴進(jìn)口，但由于價(jià)格較貴，不宜大批量引進(jìn)。大花蔥的常規(guī)繁殖依靠種子繁殖和分株繁殖，其中，種子繁殖從播種到開花所經(jīng)歷的時(shí)間較長，而分株繁殖形成的子球大小不一，且繁殖速度較慢，難以滿足市場需求。因此，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)培育大花蔥種苗、種球是解決大花蔥繁殖問題的可靠途徑。但目前，有關(guān)大花蔥組織培養(yǎng)方面的研究國內(nèi)未見報(bào)道，鑒于此，筆者對大花蔥愈傷組織誘導(dǎo)、分化及不定芽增殖的相關(guān)技術(shù)要點(diǎn)進(jìn)行了研究，以期為今后建立大花蔥組培種球繁殖技術(shù)體系進(jìn)行技術(shù)積累。1材料和方法1.1試驗(yàn)材料試驗(yàn)材料為大花蔥鱗球莖，由上海上房園林植物研究所有限公司提供，品種為“舒伯特”。取材時(shí)間為2020年1月。1.2測試方法1.2.1表皮的預(yù)處理選擇天氣晴好的中午，將種植在田間的大花蔥鱗球莖完整挖出，去除泥土后帶回實(shí)驗(yàn)室。先將鱗球莖頂部的葉片及基部的根系剔除干凈，再將外表皮剝?nèi)?，在加入洗潔精的清水中浸?min，然后在流水下沖洗45min。在超凈工作臺上先用75%酒精震蕩消毒30s，再分別用0.05%、0.1%的升汞，分別消毒10、15、20min，在消毒劑中加入2～3滴吐溫-20，消毒結(jié)束后用無菌水清洗5次，時(shí)間為5min，最后用無菌紗布吸干表面水分待接種。30d后統(tǒng)計(jì)外植體成活率，外植體成活率（%）=（成活數(shù)量÷接種數(shù)量）×100。1.2.2培養(yǎng)基配方組ms將消毒后的大花蔥鱗球莖切成0.5cm×0.5cm的小塊，接種在不同激素濃度及配比的MS培養(yǎng)基上，依據(jù)培養(yǎng)基配方不同共設(shè)5個處理，分別為：（1)6-BA0.25mg/L+2,4-D1.0mg/L;(2)6-BA0.25mg/L+2,4-D2.0mg/L;(3)6-BA0.5mg/L+2,4-D1.0mg/L;(4)6-BA0.5mg/L+2,4-D2.0mg/L;(5)6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L。各培養(yǎng)基配方均添加白砂糖30g/L、瓊脂5g/L,pH均為6.0。處理（1）、（2）、（3）、（4）采用二步法，即先暗培養(yǎng)3d再轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，10d后均轉(zhuǎn)入MS+6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+白砂糖30g/L培養(yǎng)基中；處理（5）采用一步法，即直接在以6-BA和NAA為激素組合的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)。光照培養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃、光照時(shí)間12h/d、光照強(qiáng)度3000Lux。30d后統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率，愈傷誘導(dǎo)率（%）=（出愈傷塊莖數(shù)量÷接種塊莖數(shù)量)×100。1.2.3ba/naa添加量將初代培養(yǎng)中誘導(dǎo)產(chǎn)生的質(zhì)地致密的愈傷組織塊均割，然后轉(zhuǎn)接到不同激素配比的MS培養(yǎng)基上，依據(jù)培養(yǎng)基配方不同共設(shè)4個處理，分別為：（1)6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L;(2)6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L;(3)6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L;(4)6-BA3.0mg/L+NAA0.2mg/L。各培養(yǎng)基配方均添加白砂糖30g/L、瓊脂5g/L,pH均為6.0。光照培養(yǎng)條件同1.2.2。30d后統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率，不定芽誘導(dǎo)率（%）=（出芽愈傷數(shù)量÷愈傷接種數(shù)量）×100。1.2.4培養(yǎng)基配方將誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽及致密愈傷組織接種在不同激素配比的MS培養(yǎng)基上，依據(jù)培養(yǎng)基配方不同共設(shè)5個處理，分別為：（1)6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L;(2)6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L;(3)6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L;(4)6-BA3.0mg/L+NAA0.2mg/L;(5)6-BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L。各培養(yǎng)基配方均添加白砂糖30g/L、瓊脂5g/L,pH均為6.0，光照培養(yǎng)條件同1.2.2。30d后統(tǒng)計(jì)芽增殖倍數(shù)，芽增殖倍數(shù)=繼代切割后接種數(shù)量÷繼代前芽叢數(shù)量。2結(jié)果與分析2.1升汞和消毒時(shí)間對外植體的消毒效果由于大花蔥鱗球莖是直接從田間土壤中取得的，而土壤中存在各種微生物，且外植體消毒較為困難，故本試驗(yàn)中采用滲透性強(qiáng)、消毒效果好的升汞溶液進(jìn)行消毒。由表1可知，采用濃度為0.1%升汞消毒20min的外植體無菌率最高，達(dá)70.0%，但由于消毒時(shí)間過長，部分外植體死亡，外植體成活率降低。經(jīng)綜合考慮，以濃度為0.1%的升汞消毒15min的消毒效果為最佳，外植體成活率達(dá)62.5%。2.2步法處理由表2可知，處理（1）、（2）、（3）、（4）采用二步法，即先在含2,4-D的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)10d，然后轉(zhuǎn)入不含2,4-D的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)率均達(dá)70%以上，而處理（5）采用一步法，即直接在以6-BA和NAA為激素組合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其誘導(dǎo)效果較差，誘導(dǎo)率僅為26.7%。經(jīng)綜合考慮，大花蔥愈傷組織誘導(dǎo)宜采用二步法，即先在以6-BA0.5mg/L和2,4-D2.0mg/L為激素組合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10d，再轉(zhuǎn)入MS+6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+白砂糖30g/L培養(yǎng)基中，該方法誘導(dǎo)率最高，達(dá)93.3%，且形成的愈傷組織致密，后期形成顆粒狀愈傷，有利于再分化形成不定芽。2.3-ba濃度由表3可知，在培養(yǎng)基中添加較高濃度的6-BA，愈傷組織塊形成不定芽的比例較高，但隨著6-BA濃度的進(jìn)一步提高，形成的不定芽形態(tài)差、葉片彎曲畸形，出現(xiàn)明顯的玻璃化現(xiàn)象。表明在愈傷組織誘導(dǎo)不定芽階段，過高濃度的細(xì)胞分裂素不利于形成有效的不定芽，6-BA濃度以控制在2.0mg/L以內(nèi)較為適宜。經(jīng)綜合考慮，以6-BA2.0mg/L和NAA0.2mg/L的激素配比，對愈傷組織分化不定芽的效果最好，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)77.8%。2.4叢生芽的增殖培養(yǎng)由表4可知，以在添加6-BA3.0mg/L和NAA0.2mg/L的MS培養(yǎng)基上，不定芽的增殖倍數(shù)最高。據(jù)觀察，質(zhì)地較好的愈傷組織在接種15d后，表面逐漸產(chǎn)生顆粒狀突起，在接種20d后陸續(xù)產(chǎn)生叢生芽，單芽接種在此培養(yǎng)基上也能取得很好的增殖效果，產(chǎn)生的叢生芽葉色濃綠、無玻璃化現(xiàn)象。當(dāng)6-BA濃度低于2.0mg/L時(shí)，芽增殖不明顯，增殖倍數(shù)較低；當(dāng)6-BA濃度達(dá)到4.0mg/L時(shí)，芽的增殖倍數(shù)并沒有繼續(xù)增加，反而有所降低，且芽出現(xiàn)畸形葉片，說明過高或過低的激素水平都不利于叢芽增殖。經(jīng)綜合考慮，以6-BA3.0mg/L和NAA0.2mg/L的激素配比，對不定芽的增殖效果最好，芽增殖倍數(shù)達(dá)2.65倍。3激素配比對大花蔥及其他安全性芽誘導(dǎo)率的影響本試驗(yàn)以大花蔥鱗球莖為外植體，對大花蔥愈傷組織誘導(dǎo)分化以及不定芽增殖的相關(guān)技術(shù)要點(diǎn)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，大花蔥外植體消毒以濃度為0.1%的升汞消毒15min的消毒效果較佳，外植體成活率達(dá)62.5%；大花蔥愈傷組織誘導(dǎo)宜采用二步法，即先在以6-BA0.5mg/L和2,4-D2.0mg/L為激素組合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10d，再轉(zhuǎn)入MS+6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+白砂糖30g/L培養(yǎng)基中，其誘導(dǎo)率較高，達(dá)93.3%，且形成的愈傷組織致密，后期形成顆粒狀愈傷，有利于再分化形成不定芽；在愈傷組織再分化階段，過高濃度的細(xì)胞分裂素不利于形成有效的不定芽，6-BA的濃度以控制在2.0mg/L以內(nèi)較為適宜，以6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L的激素配比較為適宜，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)77.8%。同時(shí)，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在大花蔥愈傷組織分化階段，為控制玻璃