核酸擴(kuò)增技術(shù)

1第三章核酸擴(kuò)增技術(shù)第1頁(yè)2023/10/102PolymeraseChainReaction

KarryMullis1985年發(fā)明PCR,1993年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)1993年第2頁(yè)2023/10/103應(yīng)用：DNA體外迅速擴(kuò)增技術(shù)，可將微量目標(biāo)DNA在體外擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上。原理：根據(jù)DNA半保存復(fù)制和DNA聚合酶特性，利用DNA變性和復(fù)性原理建立起來(lái)體外復(fù)制擴(kuò)增DNA片段技術(shù)。（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),

PolymeraseChainReaction）PCR技術(shù)第3頁(yè)2023/10/104主要內(nèi)容第一節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）

第二節(jié)其他PCR有關(guān)技術(shù)第三節(jié)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)第四節(jié)PCR產(chǎn)物分析第五節(jié)臨床基因擴(kuò)增質(zhì)量管理第4頁(yè)2023/10/105一、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)簡(jiǎn)史Watson、Crick：DNA雙螺旋構(gòu)造Meselson、Stahl:半保存復(fù)制模型

Khorana：最早提出體外擴(kuò)增核酸構(gòu)想Kary.B.Mullis：發(fā)明聚合酶鏈反應(yīng)Saiki：發(fā)覺(jué)耐熱DNA聚合酶

PCR技術(shù)是生物技術(shù)領(lǐng)域中最主要四大生物技術(shù)（即核酸擴(kuò)增技術(shù)、分子克隆技術(shù)、蛋白工程技術(shù)和細(xì)胞融合技術(shù)）之一。第一節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)第5頁(yè)2023/10/106PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA半保存復(fù)制核酸體外擴(kuò)增構(gòu)想聚合酶鏈反應(yīng)發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)第6頁(yè)2023/10/107PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA半保存復(fù)制核酸體外擴(kuò)增構(gòu)想聚合酶鏈反應(yīng)發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物第7頁(yè)2023/10/108PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA半保存復(fù)制核酸體外擴(kuò)增構(gòu)想聚合酶鏈反應(yīng)發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶第8頁(yè)2023/10/109PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA半保存復(fù)制核酸體外擴(kuò)增構(gòu)想聚合酶鏈反應(yīng)發(fā)明DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’GGAUCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’AUCGCG5‘ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’變性復(fù)性加熱退火第9頁(yè)2023/10/1010PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA變性與復(fù)性核酸體外擴(kuò)增構(gòu)想聚合酶鏈反應(yīng)發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA變性與復(fù)性變性復(fù)性加熱退火第10頁(yè)2023/10/1011PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA變性與復(fù)性核酸體外擴(kuò)增構(gòu)想聚合酶鏈反應(yīng)發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA變性與復(fù)性變性復(fù)性加熱退火第11頁(yè)2023/10/1012PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA半保存復(fù)制核酸體外擴(kuò)增構(gòu)想聚合酶鏈反應(yīng)發(fā)明1971年，Khorana提出：在體外，通過(guò)DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不停反復(fù)該過(guò)程便可克隆擴(kuò)增基因。但由于當(dāng)初體外引物合成困難，以及70年代基因工程技術(shù)發(fā)明使體內(nèi)克隆基因成為也許，因此，Khorana構(gòu)想被人們遺忘了……第12頁(yè)2023/10/1013PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA復(fù)制核酸體外擴(kuò)增構(gòu)想聚合酶鏈反應(yīng)發(fā)明1985年，美國(guó)PE-Cetus公司Mullis等測(cè)序工作人員發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制最初采取E-coliDNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過(guò)程耗時(shí)，費(fèi)勁，且易犯錯(cuò)Saiki發(fā)覺(jué)耐熱DNA聚合酶，使得PCR能高效率進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)第13頁(yè)2023/10/1014二.聚合酶鏈反應(yīng)原理和過(guò)程

PCR技術(shù)事實(shí)上是在體外模擬體內(nèi)DNA半保存復(fù)制過(guò)程,在模板DNA、引物和四種dNTP存在條件下，依賴于DNA聚合酶酶促反應(yīng),由變性－退火－延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟組成。

第14頁(yè)2023/10/1015PCR基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR特點(diǎn)DNA模板DNA引物dNTPTaqDNA聚合酶第15頁(yè)2023/10/10161234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR基本原理適溫延伸3高溫變性1低溫退火2反復(fù)1~3步25~30輪目DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍第16頁(yè)2023/10/10LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce17PCR基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2反復(fù)1~3步25~30輪目DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA94℃第17頁(yè)2023/10/10LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce18PCR基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR特點(diǎn)95℃55℃引物1引物2DNA引物第18頁(yè)2023/10/10LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce19PCR基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR特點(diǎn)55℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶第19頁(yè)2023/10/10LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce20PCR基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR特點(diǎn)72℃第1輪結(jié)束94℃第2輪開(kāi)始第20頁(yè)2023/10/10LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce21PCR基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR特點(diǎn)94℃55℃72℃TaqTaqTaqTaq第21頁(yè)2023/10/10LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce22PCR基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束第22頁(yè)2023/10/10LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce23PCR基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR特點(diǎn)反復(fù)30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增第23頁(yè)2023/10/1024MorningGloryPool（牽?；ǔ啬喾腥?美國(guó)黃石國(guó)家公園

來(lái)自水生棲熱菌，其半衰期:92℃>2hr;95℃40min。最佳活性在72℃。耐熱Taq酶PCR反應(yīng)中耐熱聚合酶從何而來(lái)?第24頁(yè)2023/10/1025PCR技術(shù)關(guān)鍵問(wèn)題探討PCR體外反應(yīng)體系產(chǎn)物能否完全達(dá)成指數(shù)級(jí)增加？y=A2n

第25頁(yè)2023/10/1026PCR真實(shí)擴(kuò)增曲線圖示第26頁(yè)2023/10/1027PCR擴(kuò)增效率方程圖y=A(1+X)n

X平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù)平臺(tái)期原因：引物和dNTP等消耗完成、Taq酶失活等達(dá)到平臺(tái)期所需循環(huán)次數(shù)主要取決于模板拷貝數(shù)。第27頁(yè)2023/10/1028標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系總體積10ul-50ul模板DNA

0.1～1ug引物各0.1～0.2umol/LTaqDNA聚合酶

2.5u4種dNTP混合物各200umol/L含Mg2+緩沖液

1.5～2mmol/L三、PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系第28頁(yè)2023/10/10291.模板（template）DNA

RNA：總RNA、mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA基因組DNA質(zhì)粒DNA

最低50～100ngDNA片段

過(guò)高：非特異產(chǎn)物增加過(guò)低：產(chǎn)量減少第29頁(yè)2023/10/10LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce302.引物（primers)

引物是人工合成寡核苷酸，決定PCR擴(kuò)增特異性和長(zhǎng)度。第30頁(yè)2023/10/10LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce31引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)①引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜特定條件下可擴(kuò)增加至10kb片段②引物長(zhǎng)度：

18-30bp，常用為20bp左右引物有效長(zhǎng)度不能大于38bp，不然最適延伸溫度會(huì)超出TaqDNA聚合酶最適溫度（72℃）③引物堿基：G+C含量以45-55%為宜G+C太少效果不佳，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶；ATGC最佳隨機(jī)分布，避免連續(xù)4個(gè)以上相同核苷酸第31頁(yè)2023/10/10LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce32引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)構(gòu)造避免引物內(nèi)部互補(bǔ)，尤其是2個(gè)引物間3’端互補(bǔ)

⑤引物特異性

與其他基因無(wú)顯著同源性，3’端堿基要求嚴(yán)格配對(duì)。

⑥引物5’端可加上合適酶切位點(diǎn)或修飾成份擴(kuò)增靶序列最佳有合適酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處第32頁(yè)2023/10/1033

偏低：產(chǎn)量減少。

偏高：非特異產(chǎn)物擴(kuò)增及錯(cuò)配，增加引物之間形成引物二聚體，產(chǎn)量減少。

引物用量用量：0.1-0.2umol/L（終濃度）500bp－200bp－100bp－第33頁(yè)2023/10/10343.TaqDNA聚合酶(DNApolymerase)量：1-2.5u/100ul偏高：引物非特異產(chǎn)物擴(kuò)增偏低：產(chǎn)物量減少特性：(耐高熱)熱穩(wěn)定性:92.5℃、95℃、97.5℃時(shí)，半衰期分別為40min、30min、5min保真性:TaqDNA聚合酶沒(méi)有3’-5’外切酶活性，也許產(chǎn)生錯(cuò)配；Pwo、

Vent、Pfu等具有3’-5’外切酶活性,屬于高保真酶。第34頁(yè)2023/10/10354.dNTP

dNTP：包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP。每一種dNTP量一致：20-200umol/L

dNTP會(huì)絡(luò)合Mg2+，當(dāng)PCR需要較高濃度dNTP時(shí)，應(yīng)在反應(yīng)體系中合適增加Mg2+濃度。

Mg2+過(guò)高：加快反應(yīng)速度，還可增加堿基錯(cuò)誤摻入率和試驗(yàn)成本。

Mg2+過(guò)低：可提升試驗(yàn)精確性，反應(yīng)速度下降。第35頁(yè)2023/10/10365.PCR緩沖液（PCRbuffer）

一般組成：50mMKCl,1.5mMMgCl2

，10-50mMTris-Cl(室溫PH8.3，升溫后PH7.2)Mg2+濃度：標(biāo)準(zhǔn)1.5mM，影響TaqDNA聚合酶活性，需個(gè)別優(yōu)化。酶保護(hù)劑：牛血清白蛋白BSA、明膠、非離子去污劑（如Tween20）變性劑：二甲亞砜（DMSO）第36頁(yè)2023/10/10LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce37

自動(dòng)熱循環(huán)反應(yīng)儀變性94℃延伸72℃退火Tm-5℃25-35個(gè)循環(huán)1.PCR儀工作參數(shù)設(shè)置94/95℃30～60sec，Tm-5℃30～60sec，72℃30～60sec，循環(huán)30次，最后72℃延伸5min。四、PCR一般方案第37頁(yè)2023/10/1038PCR反應(yīng)各步驟溫度確定依據(jù)第38頁(yè)2023/10/1039PCR反應(yīng)延伸時(shí)間

TaqDNA聚合酶生物學(xué)活性：

72℃時(shí)酶延伸速度為1-2kb/分鐘；

高于90℃時(shí)，DNA合成幾乎不能進(jìn)行。延伸反應(yīng)時(shí)間：

根據(jù)待擴(kuò)增片段長(zhǎng)度而定，一般1Kb以內(nèi)DNA片段，延伸時(shí)間1min足夠。延伸進(jìn)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)造成非特異性擴(kuò)增帶出現(xiàn)。

第39頁(yè)2023/10/1040PCR反應(yīng)循環(huán)次數(shù)

第40頁(yè)2023/10/1041起始模板數(shù)量與足量產(chǎn)物循環(huán)次數(shù)關(guān)系起始模板DNA分子數(shù)循環(huán)次數(shù)5040-451.0×10335-401.5×10430-353.0×105

25-30第41頁(yè)2023/10/10LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce422．PCR產(chǎn)物保存與初步檢測(cè)PCR產(chǎn)物于4℃保存，取部分產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)。第42頁(yè)2023/10/1043五.PCR常見(jiàn)問(wèn)題原因分析與處理1．假陽(yáng)性①PCR產(chǎn)物是最主要污染源。②具有靶DNA序列質(zhì)粒污染。③陽(yáng)性對(duì)照污染。④標(biāo)本之間交叉污染。⑤在采集標(biāo)本時(shí)，其他污染源帶來(lái)污染。⑥Taq聚合酶中帶有細(xì)菌DNA，當(dāng)PCR擴(kuò)增片段為保守rRNA序列時(shí)，易造成假陽(yáng)性。第43頁(yè)2023/10/10442．假陰性假陰性是PCR反應(yīng)中另一種易出現(xiàn)問(wèn)題。能夠歸納下列幾方面原因:(1)標(biāo)本處理原因①處理標(biāo)本時(shí)，靶DNA丟失。②處理標(biāo)本時(shí)，雜質(zhì)成份沒(méi)有清除潔凈，帶入PCR反應(yīng)中抑制了Taq酶活性。③標(biāo)本放置不當(dāng)，模板發(fā)生降解（尤其是RNA）。第44頁(yè)2023/10/1045(2)PCR試劑問(wèn)題①TaqDNA聚合酶失活。②Mg2+濃度過(guò)低或是沒(méi)有加。(3)PCR擴(kuò)增過(guò)程中問(wèn)題①PCR擴(kuò)增儀故障。②PCR擴(kuò)增反應(yīng)液沒(méi)有加液體石蠟油。(4)PCR產(chǎn)物判定中問(wèn)題①電泳時(shí)沒(méi)有加溴化乙錠。②電泳緩沖液和凝膠使用次數(shù)過(guò)多。③凝膠濃度過(guò)低，使擴(kuò)增帶跑散。第45頁(yè)2023/10/10463．引物二聚體形成引物二聚體原因有：⑴兩個(gè)相同或不一樣引物分子之間有較多堿基配對(duì)，尤其是引物3′端有互補(bǔ)區(qū)。⑵引物模板百分比太高，可增加模板用量。⑶退火溫度過(guò)低。⑷熱循環(huán)次數(shù)過(guò)多。第46頁(yè)2023/10/1047

PCR技術(shù)參照書(shū)第47頁(yè)2023/10/1048

第二節(jié)其他PCR有關(guān)技術(shù)第48頁(yè)2023/10/10LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce49“PCR技術(shù)使研究人員進(jìn)入了“隨心所欲”操作DNA時(shí)代。它對(duì)分子生物學(xué)影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了其他所有技術(shù)”。——1993年諾貝爾頒獎(jiǎng)典禮PCR--AmazingImaginationPCR：多對(duì)多復(fù)制方式第49頁(yè)2023/10/1050以PCR為基礎(chǔ)衍生技術(shù)一、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）二、巢式PCR（nestedPCR）三、多重PCR(multiplexPCR)四、定量PCR（qPCR）五、單細(xì)胞PCR六、PCR誘導(dǎo)定向突變七、原位PCR(insituPCR)八、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)九、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）十、等溫?cái)U(kuò)增第50頁(yè)2023/10/1051一、逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）逆轉(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA

雙鏈模版PCR擴(kuò)增AAAAnAAAAnTTTT第51頁(yè)2023/10/1052逆轉(zhuǎn)錄酶選擇1．Money鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強(qiáng)聚合酶活性，RNA酶H活性相對(duì)較弱。最適作用溫度為37℃。

2．禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強(qiáng)聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42℃。第52頁(yè)2023/10/1053常用逆轉(zhuǎn)錄引物有三種：①人工合成隨機(jī)六聚體引物；②

Oligo（dT），只適合于3′端帶有poly(A)尾mRNA；③特異性引物，只適合于逆轉(zhuǎn)錄靶RNA序列，合成特異cDNA產(chǎn)物。第53頁(yè)2023/10/1054逆轉(zhuǎn)錄引物選擇1．隨機(jī)六聚體引物：Randomprimerp(dN)6是一種不特異引物。由單鏈六聚體組成：5’－d（NNNNNN）－3’

體系中所有RNA分子所有充當(dāng)了cDNA第一鏈模板。一般用此引物合成cDNA中96%起源于rRNA。隨后PCR反應(yīng)引物在擴(kuò)增過(guò)程中賦予所需要特異性。第54頁(yè)2023/10/10552．Oligo(dT)18

：是一種對(duì)mRNA3’端特異Poly(A+)尾辦法。此引物與其配對(duì)，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。由于Poly(A+)RNA僅占總RNA1-4%，故此種引物合成cDNA比隨機(jī)六聚體作為引物得到cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。逆轉(zhuǎn)錄引物選擇第55頁(yè)2023/10/10LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce56第56頁(yè)2023/10/10573.目標(biāo)基因特異引物：最特異引發(fā)辦法

用含目標(biāo)RNA互補(bǔ)序列寡核苷酸作為引物，若PCR反應(yīng)用上下游二種特異性引物，可一步法完成RT與PCR過(guò)程。逆轉(zhuǎn)錄引物選擇第57頁(yè)2023/10/1058one-stepRT-PCR：在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄引物、TaqDNA聚合酶、PCR引物、dNTP和緩沖液，直接以mRNA

為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，稱為一步法RT-PCR。two-stepRT-PCR：先在一個(gè)體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄引物、dNTP和緩沖液，以mRNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板，然后重新配制目基因PCR擴(kuò)增體系，稱為兩步法RT-PCR。逆轉(zhuǎn)錄PCR試驗(yàn)策略第58頁(yè)2023/10/10LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce59一步法RT-PCR程序編排示意1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2反復(fù)1~3步25~30輪目DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍42反轉(zhuǎn)錄第59頁(yè)2023/10/1060

試驗(yàn)：RT-PCR分析基因體現(xiàn)

用途：

定量檢測(cè)基因mRNA體現(xiàn)情況步驟：提取總RNA→逆轉(zhuǎn)錄成cDNA→以cDNA為模板PCR擴(kuò)增→電泳→檢測(cè)基因體現(xiàn)量關(guān)鍵點(diǎn)：提取總RNA質(zhì)量第60頁(yè)2023/10/1061RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳最后產(chǎn)物判定紫外光觀測(cè)共需6-8小時(shí)提取樣品RNA質(zhì)量評(píng)定試驗(yàn)安排第61頁(yè)2023/10/1062圖巢式PCR原理示意圖外引物1外引物2內(nèi)引物1內(nèi)引物2第一次PCR第二次PCR二、巢式PCR（nestedPCR）第62頁(yè)2023/10/10LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce63巢式PCR擴(kuò)增非常特異第63頁(yè)2023/10/1064三、多重PCR（multiplexPCR）

PCR一般由一對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)生一種核酸片段，以此伎倆診斷疾病效率太低。多重PCR技術(shù)是在一種反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，同步擴(kuò)增出多種核酸片段，由于每對(duì)引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度不一樣，可用電泳加以鑒別。多重PCR主要用于多種病原微生物同步檢測(cè)或病原微生物、遺傳病及癌基因分型判定。第64頁(yè)2023/10/1065多重PCR檢測(cè)特定基因序列存在或缺失

電泳引物第65頁(yè)2023/10/1066四、定量PCR（QuantitivePolymeraseChainReaction，qPCR）

定量PCR技術(shù)是指以外參或內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)對(duì)PCR終產(chǎn)物分析或PCR過(guò)程監(jiān)測(cè)，進(jìn)行PCR起始模板量定量，有兩種：半定量PCR，由于是通過(guò)PCR終產(chǎn)物電泳條帶亮度，推測(cè)起始模板量多少，精確度低；實(shí)時(shí)熒光定量PCR，通過(guò)在反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR反應(yīng)全過(guò)程，分為絕對(duì)定量和相對(duì)定量。絕對(duì)定量是檢測(cè)起始模板考貝數(shù)，相對(duì)定量用于比較基因體現(xiàn)差異。第66頁(yè)2023/10/1067

圖示：RT-PCR驗(yàn)證人參皂苷Rh2誘導(dǎo)TNFαmRNA體現(xiàn)上調(diào)25μmol/LG-Rh2

12h24h48h72h

－+－+－+－+TNFαGAPDH半定量RT-PCR應(yīng)用舉例

第67頁(yè)2023/10/1068五、單細(xì)胞PCR遺傳學(xué)家和臨床工作者始終在尋找一套完整試驗(yàn)流程來(lái)檢測(cè)辨別單一細(xì)胞，隨后進(jìn)行單細(xì)胞裂解，抽提mRNA，將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析，方便根據(jù)它們獨(dú)特基因組和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分群。應(yīng)用：只有單個(gè)細(xì)胞；需要單個(gè)細(xì)胞檢測(cè)第68頁(yè)2023/10/1069

單細(xì)胞PCR流程圖第69頁(yè)2023/10/10LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce70單細(xì)胞制備方式

C1?單細(xì)胞自動(dòng)制備系統(tǒng)1小時(shí)內(nèi)即可分離制備96個(gè)單細(xì)胞目前主要是利用顯微抽取、流式細(xì)胞術(shù)、激光捕捉顯微切割等技術(shù)取得分離單細(xì)胞。

第70頁(yè)2023/10/1071六、PCR誘導(dǎo)定點(diǎn)突變

基因定向突變（site-directedmutagenesis）是進(jìn)行基因改造最常用技術(shù)。

常用PCR辦法：以雙鏈DNA為模板，加熱變性后，與含突變堿基引物退火，變化特定堿基，從而將突變堿基引入DNA序列中狗嘴吐不出象牙？第71頁(yè)1.引入點(diǎn)突變ABABP2P1PCR用酶A和B消化，將突變位點(diǎn)引入PCR產(chǎn)物第72頁(yè)2.引入大片段缺失第73頁(yè)2023/10/1074七、原位PCR（insituPCR，IS－PCR）以組織固定處理細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA，并以其作為靶序列進(jìn)行PCR反應(yīng)過(guò)程稱為原位PCR。

原位PCR與常規(guī)PCR區(qū)分在于模板制備。經(jīng)脫蠟處理組織切片或直接滴加在載玻片上細(xì)胞懸液都可作為模板。

所有步驟均在載玻片上進(jìn)行。第74頁(yè)2023/10/1075

原位PCR試驗(yàn)流程示意在不破壞細(xì)胞前提下，直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在載玻片上進(jìn)行ＰＣＲ反應(yīng)?？蛇M(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。適用于檢測(cè)病理切片中含量較少靶序列。細(xì)胞或組織固定PCR檢測(cè)第75頁(yè)2023/10/1076原位PCR（直接法）

特點(diǎn)：PCR擴(kuò)增時(shí)用標(biāo)識(shí)dNTP或引物,使擴(kuò)增產(chǎn)物帶有標(biāo)識(shí)標(biāo)識(shí)物：常用地高辛、同位素、生物素操作程序：組織細(xì)胞制備：固定、預(yù)處理原位擴(kuò)增：引物,TaqDNA聚合酶,標(biāo)識(shí)dNTP加入抗地高辛抗體，再加入底物，顯色。第76頁(yè)2023/10/1077原位雜交PCR（間接法）特點(diǎn)：PCR體系中dNTP和引物均不標(biāo)識(shí)

PCR擴(kuò)增結(jié)束后用標(biāo)識(shí)探針行原位雜交標(biāo)識(shí)物：以生物素、地高辛較為常用操作程序：組織細(xì)胞制備：固定、預(yù)處理滲入和原位擴(kuò)增：dNTP，引物,TaqDNA聚合酶擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)：ICC原位雜交：用特異性標(biāo)識(shí)探針第77頁(yè)2023/10/1078八、連接酶鏈反應(yīng)（ligasechainreaction，LCR）一種引入熱穩(wěn)定連接酶DNA體外擴(kuò)增技術(shù)。LCR既可擴(kuò)增,又可測(cè)定DNA異常,其特點(diǎn)是特異性強(qiáng),敏捷度高。

缺口LCR空隙LCR:需要聚合酶先彌補(bǔ)空隙第78頁(yè)79空隙LCR引物與模板特異性互補(bǔ)引物A和B之間、a和b之間有一段空隙空隙在DNA聚合酶作用下特異性延伸連接酶連接缺口用于病原體耐藥基因檢測(cè)。在大范圍人群中篩查無(wú)癥狀感染者最佳工具。第79頁(yè)2023/10/1080缺口LCR判定基因點(diǎn)突變第80頁(yè)RAPD是一種在整個(gè)基因組DNA內(nèi)進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增而取得多態(tài)性長(zhǎng)度DNA片段技術(shù)用一條隨機(jī)序列引物與模板DNA序列作隨機(jī)配對(duì)，反應(yīng)過(guò)程中隨機(jī)引物只有在與模板DNA互補(bǔ)后，在足夠近間距(200～2023bp)內(nèi)、方向相正確兩個(gè)引物片段之間模板DNA序列才能被擴(kuò)增九、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）第81頁(yè)

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA第82頁(yè)2023/10/1083用一系列隨機(jī)引物對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)多態(tài)性。一旦引物結(jié)合位點(diǎn)DNA序列變化以及兩擴(kuò)增位點(diǎn)之間DNA堿基缺失、插入或置換均可造成擴(kuò)增片段數(shù)目和長(zhǎng)度差異。第83頁(yè)2023/10/1084示例：某地域9株淋球菌RAPD指紋每株菌擴(kuò)增指紋分別由3～9個(gè)片段組成，共產(chǎn)生多種RAPD型。4株多重耐藥菌RAPD型相同。第84頁(yè)2023/10/1085十、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

核酸體外擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程始終維持在恒定溫度下，通過(guò)添加不一樣活性酶和各自特異性引物來(lái)達(dá)成迅速核酸擴(kuò)增目標(biāo)。

（一）環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）（二）核酸序列依賴性擴(kuò)增（NASBA）主要用于RNA擴(kuò)增、檢測(cè)及測(cè)序。第85頁(yè)2023/10/1086引物A靶RNA引物BRNAcDNAAMV-RT3'5'5'5'3'5'3'5'3'cDNA雙鏈cDNA模板

5'5'3'3'5'3'引物BRNaseHAMV-RTT7RNA聚合酶100-1000RNA擴(kuò)增子5'3'5'3'3'5'3'5'引物A3'5'5'RNAseHRNARNAcDNAcDNANASBA原理示意圖引物A5’端帶有T7RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。程序：65℃變性1min,37℃反應(yīng)1～1.5小時(shí)第86頁(yè)2023/10/1087NASBA特點(diǎn)：RNA擴(kuò)增、檢測(cè)

特點(diǎn)：為操作簡(jiǎn)便，不需特殊儀器，不需溫度循環(huán)。整個(gè)反應(yīng)過(guò)程由三種酶控制，循環(huán)次數(shù)少，特異性好。

幾點(diǎn)注意：（1）反應(yīng)是在37℃恒溫中進(jìn)行；（2）產(chǎn)物有反義RNA和cDNA，RNA數(shù)高于cDNA（90：1）；（3）效率高于PCR：擴(kuò)增到105僅要15min

，PCR要85min。（4）檢測(cè)成本高，大多處于研究階段(在動(dòng)物疫病預(yù)防控制方面，NASBA辦法已成為診斷禽流感病毒國(guó)家診斷標(biāo)準(zhǔn)辦法之一）第87頁(yè)1、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種A.體外特異性轉(zhuǎn)錄RNA過(guò)程

B.體外翻譯蛋白質(zhì)過(guò)程C.體外特異性轉(zhuǎn)錄DNA過(guò)程

D.體外特異性復(fù)制DNA過(guò)程E.體內(nèi)特異性復(fù)制DNA過(guò)程2、決定PCR反應(yīng)特異性和PCR長(zhǎng)度物質(zhì)是A.模板

B.dNTPC.引物

D.緩沖液

E.TaqDNA聚合酶88練習(xí)題第88頁(yè)3、有關(guān)PCR引物描述，不正確是A.引物長(zhǎng)度一般在18～25bpB.引物內(nèi)部不能存在連續(xù)互補(bǔ)序列，避免產(chǎn)物二聚體和發(fā)夾構(gòu)造C.引物中G+C含量占45%～55%D.引物3’能夠帶有生物素、熒光素或酶切位點(diǎn)E.兩條引物Tm值應(yīng)當(dāng)盡可能相近4、DNA鏈Tm主要取決于核酸分子A.A-T含量

B.C-G含量

C.A-G含量D.T-G含量

E.C-T含量5、以mRNA為模板合成cDNA酶是A.DNA酶

B.TaqDNA聚合酶

C.末端轉(zhuǎn)移酶D.RNA酶

E.反轉(zhuǎn)錄酶89第89頁(yè)6、一條引物序列是GACTCCATGATACGATCTACTG，它Tm值約為A.68℃B.58℃C.64℃D.72℃E.46℃7、平臺(tái)效應(yīng)出現(xiàn)與下列哪個(gè)原因關(guān)系密切A.引物濃度

B.初始模板量

C.TaqDNA聚合酶濃度D.Mg2+濃度

E.反應(yīng)變性時(shí)間90第90頁(yè)8、下列除什么外是PCR反應(yīng)體系中必需存在成份A.引物

B.模板

C.dNTPD.Mg2+E.DMSO9、下列因子不影響聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)忠實(shí)性是A.退火溫度

B.反應(yīng)pH值

C.牛血清白蛋白D.MgCl2E.TaqDNA聚合酶91第91頁(yè)10、多重PCR描述中正確是A、同一種模板，多種不一樣引物B、相同引物，多種不一樣模板C、多種模板，多種引物D、引物Tm值、反應(yīng)時(shí)間和溫度、反應(yīng)緩沖液等盡也許不一致以辨別不一樣產(chǎn)物E、同一反應(yīng)內(nèi)各擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小應(yīng)盡也許相同或接近11、能夠用來(lái)判斷不一樣生物體之間基因組DNA信息是哪一種PCR技術(shù)A.逆轉(zhuǎn)錄PCRB.原位PCRC.連接酶鏈反應(yīng)D.隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性PCRE.原位雜交PCR92第92頁(yè)12、下列哪一項(xiàng)PCR技術(shù)能夠檢測(cè)固定組織DNA或RNAA.逆轉(zhuǎn)錄PCRB.單細(xì)胞PCRC.原位PCRD.巢式PCRE.熒光PCR13、當(dāng)標(biāo)本核實(shí)量非常低難以擴(kuò)增時(shí)，可采取下列哪項(xiàng)PCR技術(shù)A.逆轉(zhuǎn)錄PCRB.單細(xì)胞PCRC.原位PCRD.巢式PCRE.熒光PCR93第93頁(yè)第三節(jié)實(shí)時(shí)熒光定量PCR第94頁(yè)常規(guī)PCR：借助電泳對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及定性分析。定量PCR技術(shù)：利用熒光信號(hào)變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一種循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量變化，最后精確對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。常規(guī)vs實(shí)時(shí)第95頁(yè)熒光定量實(shí)時(shí)PCR與一般PCR比較敏捷度高敏捷熒光檢測(cè)較電泳檢測(cè)敏捷度高特異性高使用引物和熒光探針同步與模板特異性結(jié)合，提升了PCR反應(yīng)特異性定量精確全程監(jiān)控，精確算法進(jìn)行定量無(wú)需跑膠，自動(dòng)化程度高第96頁(yè)熒光信號(hào)檢測(cè)辦法DNA交聯(lián)熒光染料技術(shù)2.水解探針技術(shù)3.雜交探針技術(shù)4.分子信標(biāo)技術(shù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)第97頁(yè)1.DNA結(jié)合染料技術(shù)PCR反應(yīng)體系中加入SYBRGreenI染料，能選擇性地?fù)饺胫岭p鏈DNA分子中，并且產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光PCR過(guò)程中，SYBRGreenI染料結(jié)合到新合成雙鏈DNA分子中，結(jié)合熒光信號(hào)和DNA含量成正比第98頁(yè)

第99頁(yè)長(zhǎng)處：成本較低，無(wú)須對(duì)引物或探針進(jìn)行特殊熒光標(biāo)識(shí)，操作亦比較簡(jiǎn)單缺陷：特異性不夠，染料分子會(huì)結(jié)合到非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生雙鏈分子和引物二聚體中，使反應(yīng)體系中熒光本底較高第100頁(yè)例子：熒光定量PCR檢測(cè)肺炎鏈球菌comE基因轉(zhuǎn)錄水平辦法流程：1、標(biāo)準(zhǔn)品制備：一般PCR擴(kuò)增出comE基因片斷→裝入克隆質(zhì)?！肯♂尀?09拷貝作為標(biāo)準(zhǔn)品備用2、定量檢測(cè)comE基因體現(xiàn)水平：提取RNA→逆轉(zhuǎn)錄成cDNA→與成10倍梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品一起作為模板，同步進(jìn)行熒光定量PCR→根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析成果→得到其體現(xiàn)絕對(duì)量。第101頁(yè)圖1comE基因熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖2comE基因熒光定量PCR融解曲線

表1D39菌株在CSP誘導(dǎo)后不一樣步間comE基因mRNA體現(xiàn)批次comE/16SrRNA0min10min*20min10.03410.95200.040220.19741.20470.111230.01240.40730.0160*：p<0.05，CSP誘導(dǎo)10min時(shí)comE體現(xiàn)量較0min和20min時(shí)顯著增高試驗(yàn)成果：第102頁(yè)2.水解探針技術(shù)熒光素標(biāo)識(shí)探針探針5′端和3′端分別標(biāo)識(shí)熒光報(bào)告基團(tuán)R和熒光淬滅基團(tuán)Q

探針完整時(shí)R基團(tuán)與Q基團(tuán)分別位于探針二端，Q基團(tuán)抑制R基團(tuán)使其不能發(fā)射熒光第103頁(yè)熒光信號(hào)檢測(cè)PCR過(guò)程中，TaqDNA聚合酶沿模板移動(dòng)，其5′→3′外切核酸酶活性，可逐一水解脫氧核苷三磷酸，R基團(tuán)與Q基團(tuán)隨之分離R基團(tuán)不再受Q基團(tuán)抑制便發(fā)射熒光，R基團(tuán)信號(hào)強(qiáng)弱程度與PCR反應(yīng)產(chǎn)物拷貝數(shù)成正比第104頁(yè)水解探針技術(shù)第105頁(yè)第106頁(yè)3.雜交探針技術(shù)（hybridizationprobe）反應(yīng)體系需要2條探針探針A3′端標(biāo)以熒光素作為熒光染料供體；探針B5′端標(biāo)以另一種染料，作為熒光染料受體。2個(gè)探針序列頭尾排列，并且相距僅間隔1個(gè)堿基，從而能夠進(jìn)行熒光共振能量轉(zhuǎn)移第107頁(yè)外來(lái)光源首先刺激供體熒光染料，供體便發(fā)光刺激附近受體熒光染料，使后者再發(fā)射出具另一種波長(zhǎng)信號(hào)而被檢測(cè)系統(tǒng)接收受體熒光染料在2個(gè)探針都與模板雜交時(shí)才會(huì)被激發(fā)而發(fā)射熒光信號(hào)第108頁(yè)Oligo1:FluoresceinOligo2:LCRed640ExcitationEmissionTransfer熒光共振能量傳遞（FRETProbe）第109頁(yè)長(zhǎng)處對(duì)目標(biāo)序列有很高特異性

---尤其適合于SNP檢測(cè)與MolecularBeacons相比設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單是目前應(yīng)用最廣泛一種技術(shù)TACCGGGGGTTACGAACGGTAATGA

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C

A

CCSNP檢測(cè)第110頁(yè)分子信標(biāo)是一段熒光素標(biāo)識(shí)寡核苷酸環(huán)狀區(qū)(15～30個(gè)核苷酸)柄區(qū)(5～8個(gè)堿基對(duì))組成5′末端標(biāo)識(shí)熒光基團(tuán)3′末端標(biāo)識(shí)淬滅基團(tuán)4.分子信標(biāo)技術(shù)（molecularbeacon）第111頁(yè)在自由狀態(tài)下，分子信標(biāo)構(gòu)造呈發(fā)夾狀，兩端基團(tuán)相距較近，熒光基團(tuán)將能量轉(zhuǎn)移給淬滅基團(tuán)而使熒光淬滅，熒光本底極低當(dāng)分子信標(biāo)與序列互補(bǔ)靶分子結(jié)合時(shí)，分子信標(biāo)構(gòu)型發(fā)生變化，柄部被打開(kāi)，從而使熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)而發(fā)射熒光第112頁(yè)分子信標(biāo)技術(shù)原理R第113頁(yè)定量PCR參照系統(tǒng)1.外參照系統(tǒng)設(shè)置2.內(nèi)參照系統(tǒng)設(shè)置第114頁(yè)定量PCR三個(gè)基本概念(1)擴(kuò)增曲線PCR過(guò)程中，以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)過(guò)程中熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)所做曲線。第115頁(yè)定量PCR三個(gè)基本概念(2)閾值概念在熒光定量PCR擴(kuò)增指數(shù)期，畫(huà)一條線，在此直線上，所有樣品熒光強(qiáng)度與其本底熒光強(qiáng)度差值所有相同。第116頁(yè)定量PCR三個(gè)基本概念(3)CT值PCR過(guò)程中，各樣品擴(kuò)增產(chǎn)物熒光信號(hào)達(dá)成設(shè)定閾值時(shí)，所通過(guò)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。第117頁(yè)C(t)值重現(xiàn)性相同模板在同一臺(tái)PCR儀上相同條件下反復(fù)96次擴(kuò)增擴(kuò)增曲線圖終點(diǎn)處檢測(cè)產(chǎn)物量不恒定；C(t)值具重現(xiàn)性第118頁(yè)C(t)與初始模板含量初始模板量越多，C(t)值越小C(t)與初始模板濃度對(duì)數(shù)值成線性關(guān)系熒光強(qiáng)度---循環(huán)數(shù)曲線初始模板量對(duì)數(shù)---C(T)循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線10410310610510210第119頁(yè)利用已知起始拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值取得未知樣品Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品起始拷貝數(shù)第120頁(yè)2.內(nèi)參照系統(tǒng)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品:一段人為地引入了突變序列靶基因片段內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品加入被檢樣品中一起抽提、擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品和靶基因探針?lè)謩e用2種不一樣熒光染料標(biāo)識(shí)，二者探針雜交序列不一樣第121頁(yè)同一對(duì)引物同步擴(kuò)增靶基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品，雙通道熒光檢測(cè)系統(tǒng)能夠特異地同步檢測(cè)出內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品和靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物，計(jì)算出靶基因起始拷貝數(shù)內(nèi)參照系統(tǒng)避免了由于不一樣抽提效率造成樣本間差異，使成果反復(fù)性更加好，定量更為精確,但仍不能監(jiān)控內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品和靶基因是否有一致擴(kuò)增效率第122頁(yè)定量原理初始DNA量越多,熒光達(dá)成某一值（域值）時(shí)所需要循環(huán)數(shù)越少（Ct值）Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)成域值循環(huán)數(shù)就可計(jì)算出樣品中所含模板量確定初始模板濃度第123頁(yè)4通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀3、熒光定量PCR儀熒光定量PCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)PCR儀，一般配有電腦系統(tǒng)及對(duì)應(yīng)分析軟件。第124頁(yè)P(yáng)CR技術(shù)應(yīng)用研究與生產(chǎn)基因克隆，DNA測(cè)序，分析突變?cè)\斷細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)檢測(cè)，腫瘤診斷法醫(yī)犯罪現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本分析其他……第125頁(yè)2023/10/10LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce126PCR應(yīng)用：生物學(xué)領(lǐng)域幾乎無(wú)處不用基因、DNA片段克隆人工基因構(gòu)建DNA序列測(cè)定基因定點(diǎn)突變基因型（突變）檢測(cè)，SNP分析，遺傳背景分析生物物種判定，系統(tǒng)進(jìn)化研究基因體現(xiàn)量研究（real-timePCR）

/基因體現(xiàn)譜研究（DNAchip,SAGE）第126頁(yè)2023/10/10LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce127PCR應(yīng)用：醫(yī)學(xué)檢查領(lǐng)域疾病基因檢測(cè)/遺傳病產(chǎn)前診斷致病病原體檢測(cè)腫瘤治療中癌基因檢測(cè)

會(huì)推廣到大部分疾病治療前檢測(cè)

取代Southern雜交：DNA指紋、個(gè)體識(shí)別、親子關(guān)系鑒別、法醫(yī)物證其他:

動(dòng)、植物檢疫（轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物檢測(cè)）

第127頁(yè)1)基因克隆重組質(zhì)粒質(zhì)粒DNA基因片段酶切PCR擴(kuò)增染色體DNA連接第128頁(yè)基因工程產(chǎn)品大腸桿菌胰島素重組體

+胰島素基因染色體DNAPCR擴(kuò)增第129頁(yè)

我國(guó)已同意生產(chǎn)部分生物技術(shù)藥品名稱作用rhuEPO

產(chǎn)生紅細(xì)胞rhuIFNα1b(外用)病毒性角膜炎rhuIFNα1b

乙肝、丙肝rhuIFNα2a乙肝、丙肝、皰疹等rhuIFNα2a(酵母)乙肝、丙肝rhuIFNα2b

乙肝、丙肝白血病等rhuIFNα2a(栓劑)婦科病rhuIFNα2b(凝膠劑)皰疹等rhuIFNγ類風(fēng)濕人胰島素糖尿病rhuG－CSF刺激產(chǎn)生白細(xì)胞rhuGM－CSF刺激產(chǎn)生白細(xì)胞、骨髓移植rhuGH矮小病乙肝疫苗預(yù)防乙肝rhuEGF(外用)燒傷、創(chuàng)傷EGF衍生物燒傷、創(chuàng)傷rhuIL2癌癥輔助治療rhuIL2125Ser癌癥輔助治療bFGF(外用)創(chuàng)傷、燒傷RSK溶血栓(心梗)抗IL28單抗乳膏劑銀屑病痢疾疫苗預(yù)防痢疾第130頁(yè)2)基因測(cè)序Sequencingbysynthesis(Illumina/Solexa)：readlength80-150bp,1G/run.dioldiol 1stcycledenaturation1stcycleannealingdioldioln=35total1stcycleextensiondioldioldioldiol2ndcycledenaturation2ndcycleannealingdioldioldioldioldioldiol2ndcycleextensionPCRPCR第131頁(yè)3)基因檢測(cè)A’內(nèi)源性病變基因正常人A病人外源性基因正常人(-)病人(+)第132頁(yè)β-地中海貧血癥

擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（amplificationrefractorymutationsystem，ARMS）進(jìn)行檢測(cè)（1）內(nèi)源性基因檢測(cè)—遺傳病診斷第133頁(yè)第134頁(yè)300bp1000bp800bp圖1，β珠蛋白ARMS檢測(cè)成果11、2分別為正常樣本N產(chǎn)物和M產(chǎn)物，3、5、7為檢測(cè)樣本N產(chǎn)物,4、6、8為對(duì)應(yīng)M產(chǎn)物。圖2，β珠蛋白ARMS檢測(cè)成果21為N產(chǎn)物，2為M產(chǎn)物對(duì)照產(chǎn)物861bp第135頁(yè)囊性纖維化病(CF)

第136頁(yè)鐮刀型細(xì)胞貧血癥

第137頁(yè)（2）外源性基因檢測(cè)—病原體診斷丙型肝炎病毒（HCV）感染診斷第138頁(yè)HBV感染傳統(tǒng)診斷主要采取免疫測(cè)定法檢測(cè)血清標(biāo)本中HBSAg，HbeAg，抗-Hbs，抗-HBc和抗-Hbe（兩對(duì)半），免疫學(xué)辦法雖然比較簡(jiǎn)單，但只能提供血清中HBV間接證據(jù)，無(wú)法證明是否具有傳染性，且敏感性較低。目前熒光定量PCR辦法多采取TaqMan探針，一般根據(jù)HBV基因中高度保守序列來(lái)設(shè)計(jì)，能夠檢測(cè)少至10拷貝/mLHBVDNA。檢測(cè)限范圍寬為250－2.5×109拷貝/mL，是傳統(tǒng)辦法良好補(bǔ)充。乙型肝炎病毒（HBV）PCR檢測(cè)第139頁(yè)

普遍以為HBeAg陽(yáng)性者具有較強(qiáng)傳染性，而HBeAb出現(xiàn)說(shuō)明病情好轉(zhuǎn)或穩(wěn)定，其傳染性弱。這113例HBeAg陰性患者檢出42例HBV-DNA陽(yáng)性，陽(yáng)性率37.2%，具有傳染性。A組(HBsAg、抗-HBe、抗-HBc均陽(yáng)性)，B組(HBsAg、抗-HBc均陽(yáng)性)，C組（抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc均陽(yáng)性），D組（抗-HBc陽(yáng)性），E組（抗-HBe、抗HBc陽(yáng)性）血清學(xué)模式例數(shù)陽(yáng)性數(shù)陽(yáng)性率A組622845.2B組16637.2C組12433.2D組15212.5E組8117.2合計(jì)1134237.2表1不一樣模式HBeAg陰性乙肝患者HBV-DNA陽(yáng)性率（%）第140頁(yè)目前結(jié)核病確診主要依靠痰片染色，抗酸桿菌和結(jié)核桿菌培養(yǎng)法判定。但涂片陽(yáng)性率不高，且不能確診；培養(yǎng)法需較長(zhǎng)時(shí)間。ELISA和RIA法敏感性低，尚不能直接檢測(cè)臨床標(biāo)本。結(jié)核分枝桿菌感染分子診斷第141頁(yè)結(jié)核分枝桿菌(TB)FQ-PCR檢測(cè)與常規(guī)檢測(cè)比較

北京胸科醫(yī)院、北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所、上海肺科醫(yī)院三家醫(yī)院考評(píng)情況。

醫(yī)