第六章：胚乳培養(yǎng)

第六章：胚乳培養(yǎng)第六章胚乳培養(yǎng)第六章：胚乳培養(yǎng)胚乳培養(yǎng)胚乳在被子植物中，大多數(shù)（超過(guò)81%）是雙受精產(chǎn)物。當(dāng)雄配子進(jìn)入胚囊時(shí)，它由二個(gè)極核和一個(gè)雄配子融合而形成的胚乳核發(fā)育而成，所以在倍性上大多屬于三倍體組織。胚乳又是供胚生長(zhǎng)發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)倉(cāng)庫(kù)。或遲或早，胚乳都會(huì)被胚在發(fā)育時(shí)吸收而消耗掉。只有蘭科、豆科、菱科及河苔草科植物，種子中不形成胚乳或幾乎不形成胚乳，它們的營(yíng)養(yǎng)存在子葉內(nèi)。第六章：胚乳培養(yǎng)植物胚乳的發(fā)育特性植物胚乳可以分為兩大類(lèi)：被子植物胚乳和裸子植物胚乳。被子植物胚乳是雙受精的產(chǎn)物，它由二個(gè)極核和一個(gè)雄配子融合形成，所以，在染色體倍性上它屬于三倍體組織。裸子植物很特殊，它的胚乳在受精前就已形成。裸子植物的胚乳為配子體的一部分，由大孢子直接分裂發(fā)育而成，因此它是單倍體組織。第六章：胚乳培養(yǎng)植物胚乳的發(fā)育特性胚乳(endosperm)按發(fā)育初期是否形成細(xì)胞壁可分為三種類(lèi)型：核型胚乳(nucleartype)胚乳最初發(fā)育經(jīng)過(guò)一段游離核階段，絕大多數(shù)被子植物的胚乳屬于核型胚乳。游離核階段時(shí)間長(zhǎng)短因植物不同而異。

第六章：胚乳培養(yǎng)植物胚乳的發(fā)育特性幾種植物游離核時(shí)間比較植物類(lèi)型形成細(xì)胞壁時(shí)的游離核數(shù)咖啡屬4核還陽(yáng)參屬8核～16核小麥100核左右報(bào)春花、芒果、蘋(píng)果、柑橘幾百核左右第六章：胚乳培養(yǎng)植物胚乳的發(fā)育特性細(xì)胞型胚乳(cellulartype)和核型胚乳不同，細(xì)胞型胚乳的發(fā)育不經(jīng)過(guò)游離核階段而按正常的細(xì)胞分裂方式進(jìn)行。胚乳初生核第一次分裂后即形成兩個(gè)子細(xì)胞，以后每次分裂都形成細(xì)胞壁。某些合瓣花植物，如煙草、芝麻、以及番茄等是屬于次類(lèi)。

第六章：胚乳培養(yǎng)植物胚乳的發(fā)育特性沼生目型胚乳(helobialtype)是核型與細(xì)胞型之間的中間型。初生胚乳核第一次分裂為細(xì)胞型，以后兩個(gè)細(xì)胞中的核進(jìn)行游離核分裂。第六章：胚乳培養(yǎng)胚乳培養(yǎng)研究熱點(diǎn)1.胚乳細(xì)胞的全能性。在離體培養(yǎng)下，胚乳細(xì)胞是否與其他體細(xì)胞或花粉一樣，具有全能性而再生成為植株。2.大多數(shù)被子植物的胚乳是三倍體的，能否通過(guò)胚乳培養(yǎng)獲得三倍體植株并得到無(wú)籽結(jié)實(shí)；通過(guò)胚乳培養(yǎng)技術(shù)，探索改良農(nóng)、林及園藝植物三倍體育種技術(shù)的可能性。3.研究離體下胚與胚乳的關(guān)系。第六章：胚乳培養(yǎng)胚乳培養(yǎng)中存在的問(wèn)題到2006年，約有對(duì)60種植物的胚乳進(jìn)行過(guò)培養(yǎng)。它們中有羅核氏木、蘋(píng)果、柚、橙、檀香、獼猴桃、玉米、大麥、小黑麥、水稻、馬鈴薯、枸杞、錦豐梨、核桃等胚乳培養(yǎng)得到了再生植株。其余的或只有根、葉、芽的分化或仍只停留于愈傷組織等階段。第六章：胚乳培養(yǎng)胚乳培養(yǎng)中存在的問(wèn)題在獲得了再生植株的種類(lèi)中，只有獼猴桃、枸杞的試管苗已大量移栽成活并在大田開(kāi)花結(jié)果，這是胚乳培養(yǎng)中從實(shí)驗(yàn)室走向大田生產(chǎn)的一個(gè)很大突破。它不但為胚乳培養(yǎng)技術(shù)用于育種提供了可能，也為胚乳培養(yǎng)再生植株的遺傳學(xué)等的研究積累了豐富的資料。第六章：胚乳培養(yǎng)胚乳培養(yǎng)中存在的問(wèn)題從染色體數(shù)目的分析表明，胚乳愈傷組織及胚乳植株染色體數(shù)目變化很大。如在蘋(píng)果“金冠”和“紅玉”的胚乳植株中，其根尖染色體數(shù)目分別為32～48和27～58左右，其中多于35條非整倍體細(xì)胞十分普遍。而直正三倍體的細(xì)胞卻很少。在大麥的胚乳培養(yǎng)中根尖染色體數(shù)目可以從1到4倍，另外還有許多具6、8、11、12、13條染色體的非整倍體細(xì)胞。第六章：胚乳培養(yǎng)胚乳培養(yǎng)中存在的問(wèn)題倍性的混亂，在胚乳培養(yǎng)中是較為普遍的現(xiàn)象。它們中，除了有三倍體和多倍體以外，多數(shù)是具多種倍性細(xì)胞所組成的嵌合體。這在希望從三倍體的胚乳誘導(dǎo)形成三倍體植物的設(shè)想方面又增加了新的障礙。第六章：胚乳培養(yǎng)胚乳培養(yǎng)中存在的問(wèn)題但從體細(xì)胞無(wú)性系變異的角度出發(fā)，胚乳再生植株后代倍性的不一致性，可以產(chǎn)生出不同類(lèi)型的非整倍體和各種多倍體株系，可為多倍體育種開(kāi)辟了一條新的途徑。第六章：胚乳培養(yǎng)胚乳培養(yǎng)中存在的問(wèn)題此外，還可以從理論上探討引起倍性混亂的原因及其控制的可能性，研究胚乳植株形態(tài)發(fā)生規(guī)律及其遺傳性狀變化問(wèn)題以及胚和胚乳的關(guān)系等等。第六章：胚乳培養(yǎng)胚乳培養(yǎng)中應(yīng)注意的問(wèn)題1.確定適宜的發(fā)育時(shí)期胚乳的發(fā)育，大致可以分為早期、旺盛生長(zhǎng)期和成熟期三個(gè)階段。處于發(fā)育早期的胚乳，如核型胚乳的游核時(shí)期或剛剛形成細(xì)胞時(shí)期的胚乳，難于培養(yǎng)產(chǎn)生愈傷組織或形成器官。生長(zhǎng)旺盛期的胚乳，大多是取材的最合適時(shí)期，以前培養(yǎng)成功的植物，大都是取這個(gè)時(shí)期的胚乳,如大麥、水稻、蘋(píng)果、獼猴桃等。少數(shù)是取成熟時(shí)期的胚乳也能獲得成功，如蓖麻、巴豆、麻風(fēng)樹(shù)、羅氏核實(shí)木等。第六章：胚乳培養(yǎng)胚乳培養(yǎng)中應(yīng)注意的問(wèn)題植物種類(lèi)不同，胚乳生長(zhǎng)旺盛階段的日期也不會(huì)一樣，此時(shí)的胚乳具有：胚已分化完成，胚乳已充分生長(zhǎng)，幾乎達(dá)到成熟時(shí)大??；外觀(guān)為乳白色半透明的固體，且富有彈性等特點(diǎn)。在開(kāi)始對(duì)任何一種植物進(jìn)行胚乳培養(yǎng)時(shí)，除了要查閱有關(guān)文獻(xiàn)外，還應(yīng)事先按期采集和固定開(kāi)花的材料作為系統(tǒng)觀(guān)察，以確認(rèn)該植物胚乳的發(fā)生類(lèi)型和發(fā)育時(shí)期，為下一步深入工作打好基礎(chǔ)。第六章：胚乳培養(yǎng)胚乳培養(yǎng)中應(yīng)注意的問(wèn)題不同的植物胚乳的最適宜取材日期是不同的，在單子葉植物中，百合是傳粉后的9～10天，水稻是傳粉后的5～7天，玉米是8～11天，小麥?zhǔn)?～11天，大麥?zhǔn)?天，小黑麥雜種胚乳是7～14天。在雙子葉植物中，黃瓜是傳粉后的7～10天，蘋(píng)果為傳粉后的30天，獼猴桃則要80天左右，梨、枸杞為未成熟胚乳，檀香為成熟胚乳。第六章：胚乳培養(yǎng)胚乳培養(yǎng)中應(yīng)注意的問(wèn)題總之，工作一開(kāi)始，要認(rèn)真對(duì)不同發(fā)育時(shí)期胚乳進(jìn)行培養(yǎng)，篩選出一個(gè)最適宜于誘導(dǎo)及分化的胚乳取材時(shí)間是培養(yǎng)成功的保證。第六章：胚乳培養(yǎng)胚乳培養(yǎng)中應(yīng)注意的問(wèn)題2.嚴(yán)格區(qū)分胚乳與其他組織取胚乳接種時(shí)，由于胚乳包圍著胚，如何絕對(duì)地使胚乳與胚分離而不帶胚或包裹著胚的珠心、珠被組織，是保證實(shí)驗(yàn)正確性的重要環(huán)節(jié)。否則，在胚乳外植體中混入二倍體細(xì)胞或組織，它們?cè)鲋骋话阌州^胚乳快，這樣不但影響了胚乳的誘導(dǎo)和分化，而且常常會(huì)形成二倍體愈傷組織與胚乳愈傷組織混雜的局面。第六章：胚乳培養(yǎng)胚乳培養(yǎng)中應(yīng)注意的問(wèn)題為了保證獲得純凈一致的胚乳外植體，在接種后3～4天內(nèi)應(yīng)及時(shí)觀(guān)察、檢查。把一些變綠（胚及胚的切碎部分，在培養(yǎng)早期容易出現(xiàn)色澤），或其它異樣色澤的接種物除掉。但如果要進(jìn)行胚在胚乳培養(yǎng)中作用的試驗(yàn)，則可將胚與胚乳放在同一培養(yǎng)基中培養(yǎng)并使胚與胚乳分開(kāi)放置在不同的位置。第六章：胚乳培養(yǎng)胚乳培養(yǎng)中應(yīng)注意的問(wèn)題關(guān)于胚在胚乳培養(yǎng)中的作用問(wèn)題，Bhojiwani(1966)在巴豆和羅氏核實(shí)木的研究中，認(rèn)為胚乳培養(yǎng)中必須有胚存在，胚乳愈傷組織和體胚的產(chǎn)生以及增殖均依賴(lài)于胚在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物（胚因素）來(lái)提供營(yíng)養(yǎng)。在枸杞胚乳培養(yǎng)中，帶胚的試驗(yàn)，均出現(xiàn)提高了胚乳愈傷組織誘導(dǎo)率的效果。但在小黑麥、水稻、大麥、蘋(píng)果、馬鈴薯等的胚乳培養(yǎng)中，不帶胚的胚乳培養(yǎng)，同樣也可產(chǎn)生愈傷組織或分化出胚狀體和芽。第六章：胚乳培養(yǎng)胚乳培養(yǎng)中應(yīng)注意的問(wèn)題3.合理使用植物激素植物激素的種類(lèi)和濃度對(duì)胚乳愈傷組織的誘導(dǎo)和器官建成起著決定性的作用。在不加任何激素的培養(yǎng)基上，胚乳外植體很少或完全不能啟動(dòng)。不同植物的胚乳培養(yǎng)要求有不同的外源激素及合理的細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的配比。如大麥胚乳愈傷組織產(chǎn)生和生長(zhǎng)，2,4－D是必要的，柚胚乳植株的產(chǎn)生必須加入高濃度（15mg/L）赤霉素；第六章：胚乳培養(yǎng)胚乳培養(yǎng)中應(yīng)注意的問(wèn)題獼猴桃胚乳培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)玉米素3mg/L與2,4－D0.5mg/L配合時(shí)，產(chǎn)生胚性愈傷組織，并在1mg/L玉米素中分化出體細(xì)胞胚，如果玉米素3mg/L與NAA0.5mg/L配合，則不產(chǎn)生愈傷組織而是直接分化出葉狀體，在低濃度玉米素1mg/L中產(chǎn)生芽。所以，植物激素的不同與濃度配比對(duì)胚乳愈傷組織的誘導(dǎo)及分化方向有著微妙的影響。第六章：胚乳培養(yǎng)胚乳培養(yǎng)中應(yīng)注意的問(wèn)題4.注意光、溫及pH值的影響胚乳培養(yǎng)對(duì)溫度的要求，一般在24～28℃之間，在玉米胚乳培養(yǎng)時(shí)，25℃時(shí)是玉米胚乳培養(yǎng)的最適溫度，30℃時(shí)，生長(zhǎng)比25℃至少減少了50%，20度時(shí)則下降了4倍。麻風(fēng)樹(shù)和蓖麻的胚乳則以24～26℃時(shí)生長(zhǎng)最好。第六章：胚乳培養(yǎng)胚乳培養(yǎng)中應(yīng)注意的問(wèn)題對(duì)光線(xiàn)反應(yīng)，不同植物也不同。玉米胚乳適于暗培養(yǎng)，蓖麻則在1500lx的連續(xù)光照下生長(zhǎng)較好。而對(duì)黑麥草的胚乳愈傷組織，光照未顯示出任何明顯的影響。一般植物多用交替光照，即10～12h光照，14～12h黑暗條件下培養(yǎng)。第六章：胚乳培養(yǎng)胚乳培養(yǎng)中應(yīng)注意的問(wèn)題pH值的作用，一般胚乳培養(yǎng)中的pH值約在4.6～6.3之間，巴婆的胚乳愈傷組織以pH4.6～5.0時(shí)生長(zhǎng)最好，蓖麻的pH值為5.0,麻風(fēng)樹(shù)和核實(shí)木的為5.6,玉米則要求7.0。第六章：胚乳培養(yǎng)操作實(shí)例1.獼猴桃胚乳的培養(yǎng)（1）材料的選擇與培養(yǎng)在獼猴桃開(kāi)花后約70～80天，取幼果于70%酒精中過(guò)一下，再用10%安替福民溶液滅菌10分鐘。在無(wú)菌下切開(kāi)幼果，取出種子放在培養(yǎng)皿內(nèi)。在解剖鏡下剝?nèi)シN皮，這時(shí)可見(jiàn)胚乳呈乳白色，有彈性，用鑷子或解剖針輕壓胚乳的合點(diǎn)端，這時(shí)，白色、發(fā)育完全的胚就會(huì)從珠孔端擠出。剝離的胚乳外植體為中空的囊狀物。第六章：胚乳培養(yǎng)操作實(shí)例將胚乳外植體分別接種在下列培養(yǎng)基上：

（1）MS(2)MS＋玉米素1mg/L(3)MS＋玉米素3mg/L(4)MS+玉米素3mg/L+NAA0.5mg/L(5)MS+玉米素3mg/L+NAA0.5mg/L+CH400mg/L(6)MS＋玉米素3mg/L+2,4-ｄ0.5mg/L(7)MS＋玉米素3mg/L+2,4-ｄ0.5mg/L+CH400mg/L(8)MS+2,4-d1.0mg/L第六章：胚乳培養(yǎng)操作實(shí)例（2）愈傷組織的誘導(dǎo)及植株分化：接種后一周，僅在含有2,4－d的培養(yǎng)基上可產(chǎn)生白色愈傷組織，其余各組均無(wú)變化。大約培養(yǎng)15～20天，在含有玉米素、萘乙酸的2～5組，胚乳外植體表面出現(xiàn)瘤狀突起，繼之轉(zhuǎn)綠，伸展成葉狀體。如將產(chǎn)生的葉狀體材料轉(zhuǎn)接至(2)培養(yǎng)基上，即可分化出不定芽。對(duì)于產(chǎn)生愈傷組織的各組，大約在接種后15天轉(zhuǎn)至（2）培養(yǎng)基上，其中（6）、（7）組的愈傷組織，在轉(zhuǎn)移后15天，即可從愈傷組織內(nèi)分化出胚狀體并發(fā)育成完整植株。而僅含2,4－D的（8）組，則無(wú)任何器官分化。第六章：胚乳培養(yǎng)操作實(shí)例2.枸杞的胚乳培養(yǎng)（1）材料的選擇與培養(yǎng)：采集寧夏枸杞健壯植株變色期的果實(shí)，把果實(shí)在70%酒精中消毒幾秒鐘，然后用0.1%氯化汞溶液消毒6分鐘，無(wú)菌水沖洗3次。在培養(yǎng)皿內(nèi)將果實(shí)切開(kāi)，用鑷子夾出種子，在解剖鏡下剝?nèi)シN皮并去掉胚，取胚乳接種到下面培養(yǎng)基上：MS＋2,4－D2.0mg/L+Kt0.5mg/L;MS＋2,4－D0.5mg/L。蔗糖濃度為5%，培養(yǎng)溫度26度，光照時(shí)間10小時(shí)。第六章：胚乳培養(yǎng)（2）愈傷組織的誘導(dǎo)與植株分化：在上述培養(yǎng)基培養(yǎng)1周，胚乳外植體上已有愈傷組織產(chǎn)生。培養(yǎng)15～20天，愈傷組織已至蠶豆大小，淡黃色、松散，不易用鑷子夾起。培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)，培養(yǎng)基（1）、（2）上的胚乳愈傷組織誘導(dǎo)率分別為37.3%和23.1%。再將愈傷組織轉(zhuǎn)接到下面4種培養(yǎng)基上：第六章：胚乳培養(yǎng)操作實(shí)例A.MS+6-BA0.5mg/L;B.MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L;C.MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+GA2mg/L;D.MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+CH400mg/L;蔗糖均為2%。第六章：胚乳培養(yǎng)操作實(shí)例在轉(zhuǎn)接10天后，A、B、C三組培養(yǎng)基上的愈傷組織明顯長(zhǎng)大，D組上的愈傷組織則無(wú)明顯變化。但在培養(yǎng)15天后，上述4種培養(yǎng)基上的愈傷組織都有芽點(diǎn)分化，約20天后，芽開(kāi)始分化并發(fā)育成具有明顯莖、葉結(jié)構(gòu)，根系發(fā)達(dá)的植株，有的為