甲基丁香酚對(duì)缺氧復(fù)氧致人腎小管上皮細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制

甲基丁香酚對(duì)缺氧復(fù)氧致人腎小管上皮細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制

血液供應(yīng)中斷會(huì)導(dǎo)致組織或器官缺氧。立即恢復(fù)出血和灌溉。然而，在一些情況下，組織或器官的血流再灌注能進(jìn)一步加重?fù)p傷，即缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusioninjury,IRI)。腎臟IRI是導(dǎo)致急性腎損傷(acutekidneyinjury,AKI)的常見原因之一，主要表現(xiàn)為氧化應(yīng)激和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)細(xì)辛屬馬兜鈴科植物，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，已廣泛用于風(fēng)寒感冒、頭痛、牙痛、鼻塞流涕、痰飲喘咳等血清、細(xì)胞白酶及生物安全柜人腎小管上皮細(xì)胞株HK-2(上海富衡生物),甲基丁香酚(批號(hào)577501,純度≥98%)、ML385(批號(hào)S8790)購(gòu)自Selleck公司，RPMI1640及無糖RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司(批號(hào)8120340、MA0555-Aug-24F),二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)購(gòu)自Sigma公司(批號(hào)D-5879),胎牛血清(fatalbovineserun,FBS,批號(hào)16140071)、0.25%胰蛋白酶(批號(hào)25200056)購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司，BCA蛋白定量試劑盒(批號(hào)P0012S)、RIPA裂解液(批號(hào)P0013B)、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cellcountingkit-8,CCK-8,批號(hào)C0037)、活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)080620201106)、線粒體膜電位(mitochondrialmembranepotential,MMP)檢測(cè)試劑盒JC-1(批號(hào)C2006-1)均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，核因子E2相關(guān)因子2(nuclearfactorerythroid2relatedfactor2,Nrf2)抗體、血紅素氧合酶1(hemeoxygenase-1,HO-1)抗體、NADPH氧化酶4(nicotinamideadeninedinucleotidephosphataseoxidase4,Nox4)抗體購(gòu)自三鷹公司(批號(hào)00063558、00071521、00047480),生物安全柜(中國(guó)海爾，型號(hào)HR40-IIA2);CO方法hk-2細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞存活率的檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，并置于37℃、含5%COme對(duì)h-r損傷h-2細(xì)胞形態(tài)的影響造模結(jié)束后，將細(xì)胞培養(yǎng)皿置于倒置顯微鏡下觀察、拍照，記錄細(xì)胞形態(tài)改變。細(xì)胞ros含量用2′,7′-二氯熒光素乙酸鹽(2′,7′-dichlorodihydrofluoresceindiacetate,DCFH-DA)熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。造模結(jié)束后，去除培養(yǎng)基，PBS洗3遍，加10μmol·Lcck-8復(fù)氧在96孔板中于上述不同條件下培養(yǎng)細(xì)胞，復(fù)氧2h后，將10μLCCK-8溶液添加到每個(gè)孔中并孵育1h。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處的吸光度(細(xì)胞凋亡檢測(cè)磷脂結(jié)合蛋白Ⅴ(AnnexinⅤ)和碘化丙啶(PI)(上海碧云天有限公司，批號(hào)A10335)雙重染色法用于測(cè)量細(xì)胞凋亡。收集細(xì)胞上清，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化細(xì)胞后收集于流式管，300×細(xì)胞培養(yǎng)和成像細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板內(nèi)，按照MMP檢測(cè)試劑盒JC-1說明書配制試劑，吸除培養(yǎng)基，加入1mL細(xì)胞培養(yǎng)液，再加入1mLJC-1染色工作液，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20min,孵育結(jié)束后，吸除上清，用JC-1染色緩沖液洗滌2次后，熒光顯微鏡成像采集圖片。MMP正常時(shí)以紅色熒光為主，MMP下降時(shí)以綠色熒光為主，線粒體的去極化程度通過紅/綠熒光強(qiáng)度的比例來衡量。聚山梨酯鹽系膜的制備提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒行蛋白定量，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS)凝膠分離、濃縮蛋白，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，用含聚山梨酯20(吐溫20)的Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBST)溶解脫脂奶粉成5%的封閉液，室溫下封閉60min。TBST溶液洗滌后分別加入一抗(Nrf2、HO-1、Nox4稀釋1∶1000,正常臨床資料將細(xì)胞種于細(xì)胞爬片上，按計(jì)劃進(jìn)行干預(yù)后行免疫熒光染色。在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次，用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次；0.5%TritonX-100室溫通透20min,PBS浸洗玻片3次，在玻片上滴加正常山羊血清，37℃封閉30min;1∶200稀釋Nrf2一抗，4℃避光孵育過夜；PBS洗滌3遍后，綠色DyLight488熒光標(biāo)記的山羊抗兔二抗以1∶100稀釋，37℃避光孵育30min,DAPI復(fù)染，共聚焦顯微鏡進(jìn)行成像拍攝。統(tǒng)計(jì)處理所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差me預(yù)處理對(duì)hk-2細(xì)胞凋亡的影響初步探索不同濃度ME對(duì)HK-2細(xì)胞毒性，實(shí)驗(yàn)分6組，0μmol·L利用DCFH-DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，結(jié)果顯示，H/R模型組熒光強(qiáng)度明顯高于NC組；ME給藥組ROS平均熒光強(qiáng)度顯著低于模型組，表明ME可抑制H/R損傷后細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，見圖4。利用AnnexinⅤ和PI雙重染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果表明與NC組相比，模型組HK-2凋亡細(xì)胞明顯增多；ME給藥組可顯著降低HK-2細(xì)胞凋亡，表明ME預(yù)處理可改善HK-2細(xì)胞H/R損傷，抑制HK-2細(xì)胞凋亡，見圖5。通過JC-1染色，檢測(cè)H/R損傷后HK-2細(xì)胞線粒體膜電位改變。正常線粒體內(nèi)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物，呈紅色熒光；線粒體膜電位下降或喪失，JC-1以單體的形式存在于胞漿，產(chǎn)生綠色熒光。結(jié)果顯示，與NC組相比，H/R損傷后HK-2細(xì)胞綠色熒光增多，紅/綠熒光強(qiáng)度降低；經(jīng)ME處理后，與模型組相比，紅/綠熒光強(qiáng)度升高，表明ME可改善H/R損傷后HK-2細(xì)胞線粒體膜電位的下降，尤其ME濃度為40μmol·LWesternblot結(jié)果顯示，與NC組相比，H/R后HK-2細(xì)胞Nrf2、HO-1、Nox4上調(diào)；經(jīng)ME預(yù)處理，與模型組相比，Nrf2、HO-1表達(dá)均增高，Nox4表達(dá)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ML385可直接與Nrf2蛋白相互作用，抑制其功能me對(duì)nrf2細(xì)胞損傷的活性當(dāng)器官的血液供應(yīng)中斷(缺血),然后重新建立循環(huán)(再灌注)時(shí)，就會(huì)發(fā)生缺血-再灌注損傷天然化合物是大量藥物的重要來源，目前，植物提取物治療作用的研究越來越受研究者青睞。植物多酚是一種天然的抗氧化劑，可增強(qiáng)機(jī)體抵抗活性氧或活性氮(reactivenitrogenspecies,RNS)的能力，ME是中藥細(xì)辛揮發(fā)油的主要成分，研究表明，其具有多種活性，包括強(qiáng)大的抗氧化作用目前，腎I/R損傷的分子機(jī)制尚不完全清楚，腎臟皮質(zhì)髓質(zhì)交界處近端腎小管上皮細(xì)胞對(duì)缺血缺氧敏感，近端腎小管細(xì)胞是急性IRI的主要靶細(xì)胞正常情況下，Nrf2存在于細(xì)胞質(zhì)中，與(Kelch-likeECH-associatedprotein,Keap-1)結(jié)合，并通過蛋白酶體途徑迅速降解。氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf2會(huì)從Keap-1上解離進(jìn)入核內(nèi)，激活抗氧化劑反應(yīng)元件(anti-oxidantresponseelement,ARE)驅(qū)動(dòng)基因綜上所述，本研究結(jié)果表明，ME可減輕H/R處理的HK-2細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能為ME促進(jìn)Nrf2信號(hào)通路，并抑制Nox4蛋白表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化酶系統(tǒng)，及時(shí)清除ROS等有害物質(zhì)。ME可能是一種有效的減輕IRI的天然化合物。但是，ME潛在機(jī)制可能更為復(fù)雜，天然化合物的體內(nèi)作用環(huán)境與自然環(huán)境不一樣，為了將ME的治療轉(zhuǎn)化為臨床用途的可靠策略，未來有必要對(duì)ME的天然化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行相應(yīng)改造，增強(qiáng)其水溶性并降低其藥物副作用，并對(duì)其功效和作用機(jī)制進(jìn)行深入的研究。3.1me對(duì)正常培養(yǎng)中的sh-2細(xì)胞活性的影響3.2小鼠葉片主動(dòng)火炬h/r損傷大鼠細(xì)胞活性檢測(cè)HK-2細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪(oxygen-glucosedeprivation,OGD)誘導(dǎo)24h,復(fù)氧2h后,與NC組相比,H/R損傷后細(xì)胞活性顯著下降(P<0.01);與模型組相比,ME可顯著提高H/R損傷后細(xì)胞活性(P<0.01),且呈濃度依賴性,在給藥濃度20、40μmol·L3.3c組細(xì)胞的形態(tài)變化HK-2細(xì)胞經(jīng)H/R處理后,倒置顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài),結(jié)果顯示與NC組細(xì)胞相比,H/R損傷后細(xì)胞腫脹,形態(tài)變圓、體積增大,細(xì)胞間連