水生植物化感物質(zhì)對銅綠微囊藻生長抑制作用的影響

水生植物化感物質(zhì)對銅綠微囊藻生長抑制作用的影響

水生植物是健康水生態(tài)系統(tǒng)的主要初級生產(chǎn)者，在維持水生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮著重要作用。除了吸收水中的養(yǎng)分，還可以為其他生物提供場所，釋放化感物質(zhì)，以抑制周圍藻類的生長（吳振寧等人，2011）。由于化感物質(zhì)大都為植物的次生代謝產(chǎn)物,在自然水體中易降解,生態(tài)安全性好,因此利用化感活性水生植物及其化感物質(zhì)控制藻類生長,恢復水生植物占優(yōu)勢的清水穩(wěn)態(tài)生態(tài)系統(tǒng)被認為是一種行之有效且生態(tài)安全的策略(Hilt等,2008;Shao等,2013)。大量野外原位實驗和室內(nèi)控制實驗廣泛證實蘆葦(Phragmitescommunis)、香蒲(Typhaangustata)、水蔥(Scirpusvalidus)等挺水植物,穗花狐尾藻(Myriophyllumspicatum)、伊樂藻(Elodeanuttallii)、眼子菜(Potamogetonspp.)等沉水植物對藻類尤其是有害藍藻銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)均具有很強的化感抑制活性(Li和Hu,2005;Erhard和Gross,2006;Nakai等,2012;胡陳艷等,2010)。酚酸、脂肪酸、生物堿、類萜等類別的化感物質(zhì)不斷地從水生植物體內(nèi)及其分泌物中被分離出來,并得到鑒定(Waridel等,2004;Nakai等,2005;Gao等,2011;孫文浩等,1993)。前期的草藻共培養(yǎng)系統(tǒng)中,1g·L常用的化感物質(zhì)抑藻活性測試方法與大部分種植水抑藻實驗方法類似,即在暴露開始時一次性添加一定劑量的化感物質(zhì)到受試藻液中,然后觀察藻體生長和生理參數(shù)對化感物質(zhì)的響應,最常用的指標即化感物質(zhì)對藻類生長和生理指標的半數(shù)抑制濃度EC為了驗證這個假設,本研究選擇了壬酸、N苯基-1-萘胺和咖啡酸等常見的水生植物化感抑藻物質(zhì),比較單次與多次暴露對銅綠微囊藻生長的抑制效果,并從暴露頻次、暴露劑量和暴露條件等方面初步探討水生植物釋放化感物質(zhì)抑制藻類生長的作用模式,以期從生態(tài)水平上揭示水生植物的化感抑藻機制,為其科學應用于受損生態(tài)系統(tǒng)的修復和有害藻華的生態(tài)控制提供更加充分的理論指導。1材料和方法1.1培養(yǎng)條件及抑藻物質(zhì)實驗藻種銅綠微囊藻(FACHB905)購自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫,純培養(yǎng)期間為單細胞形態(tài)。保種和實驗期間均用無菌BGII培養(yǎng)基在2000lx,12h∶12h光暗比,(25±1)℃的條件下培養(yǎng)。每天早晚各手工振搖1次。抑藻測試采用對數(shù)生長期的銅綠微囊藻細胞。實驗所選水生植物的典型化感物質(zhì)包括壬酸(N5502-25G,φ≥97%,Sigma,Germany)、N-苯基-1萘胺(104043-500G,98%,Sigma-Aldrich,Germany)和咖啡酸(C0625-5G,φ≥98%,Sigma,Germany)。母液配制溶劑為分析純二甲亞砜(Tidea,America)。1.2化感物質(zhì)暴露頻次為比較化感物質(zhì)一次性暴露與多次暴露方式對銅綠微囊藻的抑制效應,實驗一以壬酸、N-苯基-1-萘胺和咖啡酸3種化感物質(zhì)為對象,參照72h抑藻測試所得化感物質(zhì)對銅綠微囊藻生長的有效抑制濃度,確定化感物質(zhì)暴露總量為2.5mg·L為研究化感物質(zhì)不同暴露頻次下的抑藻效應,實驗二以壬酸為代表,設置4個處理組。組1為實驗時按2.5mg·L為探討多次暴露方式下化感物質(zhì)添加劑量與抑藻效果間的關系,實驗三選擇壬酸和N-苯基-1萘胺2種化感物質(zhì)為研究對象,每種物質(zhì)設置3個多次暴露組,每次添加量分別為0.25、0.2和0.1mg·L為探討光暗條件對多次暴露化感物質(zhì)抑藻效果的影響,實驗四選擇壬酸和N-苯基-1-萘胺2種化感物質(zhì)為研究對象,每種物質(zhì)均設置2個多次暴露組,分別于銅綠微囊藻的光培養(yǎng)階段和暗培養(yǎng)階段,以2h間隔分5次每次添加0.5mg·L1.3助溶劑的添加量參照ISO8692標準采用250mL錐形瓶進行抑藻測試,將一定量溶解在二甲亞砜中的壬酸或N苯基-1-萘胺或咖啡酸母液按實驗設置添加到銅綠微囊藻培養(yǎng)液中。每種物質(zhì)的每個實驗均設置1個溶劑對照組,助溶劑二甲亞砜的含量與處理組相同,均為0.02%,該濃度的助溶劑不會影響銅綠微囊藻的生長。接種藻液起始密度為1×101.4數(shù)據(jù)處理與分析分別用MicrosoftExcel2010和OriginPro8.0對實驗數(shù)據(jù)進行基本分析和繪圖,不同處理之間的差異采用SPSS13.0軟件中的單因素方差分析和重復測量方差分析,多重比較采用Tukey檢驗。2結(jié)果與分析2.1多次暴露對銅綠微囊藻生長的影響2.5mg·L與單次暴露相比,壬酸、N-苯基-1-萘胺和咖啡酸3種化感物質(zhì)多次暴露對銅綠微囊藻生長的抑制作用更強。從第5天開始,多次暴露組與單次暴露組的銅綠微囊藻生長曲線呈現(xiàn)顯著差異。到第7天,壬酸、咖啡酸和N-苯基-1-萘胺單次暴露組的平均藻細胞生長抑制率分別為27.76%、38.16%和72.46%,多次暴露組則依次為51.29%、60.39%和80.92%。由此說明化感物質(zhì)低劑量多次暴露產(chǎn)生的抑藻效果比一次性高劑量暴露強,相比一次性暴露,低劑量多次暴露抑藻效應更持久。2.2單次暴露組對銅綠微囊藻生長的最高抑制率圖2顯示不同暴露頻次下化感物質(zhì)壬酸對銅綠微囊藻生長的抑制率,第3天到第7天,各個處理組的抑制率由小到大依次為組1<組2<組4<組3<組5。組1為單次暴露組,對銅綠微囊藻生長的最高抑制率出現(xiàn)在第5天,為40.5%。其余3個多次暴露組的抑藻率均高于單次暴露組。組2、組3和組4的暴露間隔時間均為2h,單次暴露量依次減少,暴露次數(shù)依次增多,而抑藻效果最好的是組3,第5天平均抑制率達到52.43%,而組2和組4第5天的平均抑制率分別為45.49%和47.99%,顯著低于組3(P<0.05)。2.3不同單次添加量對銅綠微囊藻生長和抑制率的影響由圖3可見,對照組銅綠微囊藻從第2天開始進入快速生長階段,光密度值從0.1升高至第7天的0.6。2種物質(zhì)的3個處理組銅綠微囊藻的生長曲線均顯著緩于對照組,其抑制活性均隨著添加量的減少而降低。壬酸對銅綠微囊藻生長的抑制程度隨添加量減少而明顯減弱。單次添加量0.25mg·L添加總量2.5mg·L如圖4所示,2種化感物質(zhì)在黑暗階段多次暴露對銅綠微囊藻生長的抑制率顯著高于光照階段(P<0.05)。其中壬酸光照階段暴露組平均抑制率隨時間呈拋物線形式,從第1天到第4天逐漸上升,然后緩慢下降。而黑暗階段暴露組壬酸對銅綠微囊藻的平均生長抑制率逐漸升高,到第7天達到63.64%。光照階段多次暴露的N-苯基-1-萘胺對銅綠微囊藻生長的抑制活性隨時間逐漸增強,第3天抑制率達到50.68%,第7天達到90.31%;黑暗階段多次暴露抑藻活性更強,第3天抑制率達到67.89%,隨后一直升高,第7天達到91.13%。盡管N-苯基-1-萘胺表現(xiàn)出比壬酸更強的抑藻活性,但2種物質(zhì)在黑暗階段多次暴露均比光照階段多次暴露能更好地抑制銅綠微囊藻的生長。3胺類及其它化感物質(zhì)實驗室實驗和自然水體中的原位實驗均證實共存狀態(tài)下水生植物可以高效抑制藻類的生長,而移走植物后沒有更新或補充的種植水對藻類的生長影響卻不顯著(Nakai等,1999;Wu等,2007),造成這種差異最可能的原因就是后者不存在化感物質(zhì)的持續(xù)補充和累積。本研究中選擇了壬酸、N-苯基-1-萘胺和咖啡酸3種水生植物常見化感物質(zhì),發(fā)現(xiàn)在顯著降低暴露劑量的情況下,分多次暴露的化感物質(zhì)對銅綠微囊藻生長的抑制效果不比高劑量單次暴露差,反而隨著時間的延長,表現(xiàn)出更強的抑制效應。壬酸在沉水植物穗花狐尾藻和伊樂藻種植水中均有檢測到,為抑藻活性較高的一種脂肪酸類化感物質(zhì)(Nakai等,2005;Gao等,2014)。咖啡酸在沉水植物伊樂藻、苦草和輪葉黑藻體內(nèi)及其種植水中都有檢測到,是一種活性較強的酚酸類化感物質(zhì)(Gao等,2011,2014)。N-苯基-1-萘胺很早就從室內(nèi)培養(yǎng)和野外種植的鳳眼蓮分泌液中分離鑒定到(孫文浩等,1993),近期我們又從伊樂藻、輪葉黑藻和苦草種植水中檢測到,與其同系物N-苯基-2-萘胺一樣,具有較強的抑藻活性,屬于含氮化合物。不同來源、不同結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的3種化感物質(zhì)均在低劑量多次暴露時表現(xiàn)出比高劑量單次暴露更強的抑藻效果,證實我們關于水生植物對藻類的化感抑制作用具有持續(xù)性和累積性的假設。為了進一步驗證多次暴露的抑藻作用,我們比較了不同頻次暴露壬酸對銅綠微囊藻的抑制作用,結(jié)果顯示,無論是分2次、5次還是8次的多次暴露組,壬酸對銅綠微囊藻生長的抑制率都顯著高于單次暴露組。而在多次暴露組中,抑藻效果的強弱與暴露次數(shù)、間隔時間和暴露劑量均有關。在固定間隔時間和暴露總量的情況下,壬酸抑藻效果并不總是隨著暴露次數(shù)的增加而加強,而是5次暴露強于8次暴露的抑藻效果。造成這種結(jié)果的主要原因可能與單次暴露劑量的降低有關,8次暴露間隔2h每次暴露量僅為0.31mg·L事實上,劑量-效應關系廣泛存在于水生植物及其化感物質(zhì)的抑藻作用中。暴露在0.5、2.0和8.0mg·L光照是影響包括水生植物和藻類等光合生物生長和代謝的一個重要因素。我們的前期研究顯示光照的強弱不僅影響水生植物的生長和初生代謝,也會影響水生植物次生代謝產(chǎn)物的合成和釋放(葛芳杰等,2012)。低光照下穗花狐尾藻主要的酚酸特里馬素II在植物組織中的含量比高光照下更高(Gross,2003)。穗花狐尾藻釋放的5種酚酸和3種脂肪酸在低光照下對銅綠微囊藻生長的抑制活性顯著高于高光照下的抑制活性(Nakai等,2014)。同時,自然水體中水生植物和藻類的生長均會經(jīng)歷白天的光照階段和夜晚的黑暗階段。盡管已有的研究大都在植物光照階段開展,如對水生植物化感物質(zhì)釋放情況的分析以及抑藻活性測試中化感物質(zhì)的暴露等(Gao等,2011)。但關于自然水體中水生植物釋放化感物質(zhì)抑藻的階段目前仍不清楚?？紤]到水生植物在白天光照階段需要更多的能量用于植物的光合作用,而夜晚的黑暗階段有可能從呼吸作用釋放的能量中獲取更多用于次生代謝產(chǎn)物的合成(武維華,2012)。另外有些化感物質(zhì)具有光敏性,如焦酚,光照條件下很容易在水溶液中發(fā)生降解(Nakai等,2000)。我們設計了白天光照階段和夜晚黑暗階段分別多次暴露