仙人掌超氧化物歧化酶提取純化工藝研究

仙人掌超氧化物歧化酶提取純化工藝研究

美國佳倫塔杏仁（ourma）出生于墨西哥。1997年，農(nóng)業(yè)部成功引進中國。它在中國20多年里廣泛種植，成為消費者喜愛的蔬菜。米邦塔仙人掌營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、維生素、氨基酸、礦物質(zhì)、不飽和脂肪酸等營養(yǎng)成分以仙人掌為原料，以藍莓、靈芝、西瓜、獼猴桃等作為復(fù)配原料，開發(fā)出的復(fù)合飲料和發(fā)酵乳制品報道較多試驗以仙人掌為原料，提取和部分純化SOD，以黃瓜作為復(fù)配材料制備仙人掌SOD功能飲料，為仙人掌資源的深加工提供參考。1材料和方法1.1實驗試劑及試劑米邦塔仙人掌（周口扶溝種植園）；黃瓜（毛莊菜市場）；蔗糖（食用級，西糖業(yè)有限公司）；乙酸鋅（食用級，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙基麥芽酚（食用級，青島花帝食品配料有限公司）；Sephadex(G-75,AmershamPharmacia）；乙二胺四乙酸二鈉（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心）；聯(lián)苯三酚（分析純，貴州遵義市建強化工有限公司）；聚乙二醇（分析純，派尼市化學(xué)試劑廠）；其他試劑均為分析純。1.2儀器、儀器和檢測方法組織搗碎勻漿機（JJ-2，金壇市億通電子有限公司）；高速冷凍離心機（GL-22M，賽特湘儀離心機儀器有限公司）；酸度計（HI253臺式，上海瀘西分析儀器廠有限公司）；自動部分收集器（BSZ-100，上海瀘西分析儀器廠有限公司）；紫外分光光度計（UV-2100，上海瀘西分析儀器廠有限公司）。1.3方法1.3.1磷酸緩沖液的制備稱200g仙人掌用蒸餾水洗凈，切成3cm×2cm的塊，加入18mLpH7.80.05mol/L的磷酸緩沖液。勻漿、過濾，濾液在4℃下，以8000r/min離心10min。收集上清液460mL，加入960mL冷丙酮，放入4℃冰箱中過夜。收集沉淀，加入95mL磷酸緩沖液溶解，總體積108mL。離心除去不溶物質(zhì)，收集上清液100mL。仙人掌SOD的提取工藝流程：1.3.2蛋白質(zhì)濃度的測定按照參考文獻1.3.3酶活力的測定在pH8.2、25℃條件下，1mL的反應(yīng)液中1min聯(lián)苯三酚在325nm波長處的自氧化速率達50%時的酶量定義為1個活力單位。按照文獻1.3.4蛋白質(zhì)濃度、酶活濃度的測定收集的上清液中加入9.54g固體硫酸銨至飽和度20%,4℃冰箱中放置2～3h。高速離心機離心10min、10000r/min，收集上清液80mL。再測蛋白質(zhì)濃度、酶活。添加固體硫酸銨37.52g至飽和度90%。放入4℃冰箱過夜。以12000r/min轉(zhuǎn)速離心40min，收集沉淀。加入8mL磷酸緩沖液溶解即為酶液。測蛋白質(zhì)濃度、酶活。1.3.5透析、攪拌將酶液移入處理好的透析袋中，在磷酸緩沖液中，4℃下透析過夜，不時攪拌。將透析完畢的透析袋，用聚乙二醇覆蓋脫水，待袋內(nèi)溶液體積濃縮到10mL左右，取出即為濃縮酶液。1.3.6聚乙二醇反滲透凝膠經(jīng)預(yù)處理，裝柱，平衡，將10mL濃縮酶液一次性裝入事先處理好的SephadexG-75柱。用磷酸緩沖液洗脫，用自動收集器收集，調(diào)整流速，每10min自動收集一管，每管約5～6mL。每隔3管測1次酶活，將有酶活的溶液試管合并，再用聚乙二醇反滲透。所得溶液即為部分純化的SOD酶液。1.3.7仙女座功能飲料的準備和檢測仙人掌SOD功能飲料的制備工藝流程：1.3.7.1.原材料的選擇、清洗和去除選擇無病斑、無蟲害、新鮮、綠色、肉質(zhì)肥厚的仙人掌片和無病蟲害、鮮嫩的黃瓜，清洗除去雜質(zhì)。1.3.7.2片仙人掌除刺，去掉仙人掌的表面硬皮后，將其切成30cm×10cm薄片。黃瓜去皮后切除兩端掛蒂，切成3～5cm厚的塊狀。1.3.7.3熱護色黃瓜90℃熱燙3～5min，投入0.04%的醋酸鋅護色液，浸泡15min。1.3.7.制備成液溶液經(jīng)熱燙護色的黃瓜迅速用水冷卻，并將燙漂液沖洗干凈，以1︰1.5(g/mL）加水打漿，制得漿液備用。仙人掌以1︰1.5(g/mL）加水打漿，制得漿液備用。1.3.7.出液過濾、攪拌制得的仙人掌漿液、黃瓜漿液用4層紗布過濾，濾出液置入燒杯中，用磁力攪拌器攪拌30～60min,4℃環(huán)境下靜置3～4h。濾出上清液，棄去沉淀。1.3.7.h4.0將稱量好的蔗糖、乙基麥芽酚加入黃瓜汁中，加入檸檬酸調(diào)pH4.0。飲料配方：黃瓜汁100mL、仙人掌汁100mL、蔗糖10g(5%）、檸檬酸0.15g(0.0008%）、乙基麥芽酚0.03g(0.002%）。1.3.7.7殺戮調(diào)配好的黃瓜汁裝瓶后采用90℃，30min殺菌，冷卻至室溫。將微波30s滅菌處理過的仙人掌汁裝入事先殺菌過的黃瓜汁中。1.3.7.8個酶活力研究按照1.3.3測定飲料中SOD酶活力。2結(jié)果與分析2.1不同純化方法對蛋白質(zhì)和酶活力的影響仙人掌經(jīng)鹽溶、鹽析、透析和SephadexG-75層析純化后，酶活力、活力回收率、提純倍數(shù)如表1所示。由表1可知，經(jīng)提取和部分純化后酶活力的回收率為19.23%，純化倍數(shù)9.13。隨著純化步驟的進行，蛋白質(zhì)和酶活力總量逐漸減少，但SOD比活力逐漸提高。仙人掌SOD粗酶總活力13760U，含量豐富，可以仙人掌為原料制備SOD功能飲料。2.2sod的洗脫從圖1中可看出，酶活力隨著洗脫體積增加而增高，在緩沖液洗脫體積在80mL左右，酶活力達到最高。洗脫過程是大分子量組分先被洗脫，小分子量的組分后被洗脫。SOD在50mL以后逐漸被洗脫出。葡聚糖凝膠（Sephadex）內(nèi)部具有網(wǎng)狀篩孔。SephadexG-75凝膠可區(qū)分分子量在3000～70000Da之間的分子，SOD分子量在32000～40000Da，可以進入SephadexG-75的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，流出時間的長短居中，如圖1中尖峰的位置所示（對應(yīng)于約83mL洗脫體積）。2.3仙人掌與仙人掌的混合式在選擇復(fù)合原材料時考慮到飲料的色澤和風(fēng)味等方面的因素，采用與仙人掌相接近的黃瓜作為飲料的另一種原材料。黃瓜本身的抗褐變能力強，并且在掩蓋仙人掌青澀味方面也起到了一定效果。2.4漂燙護色。為了保留飲料的sod酶，黃瓜可做在果蔬組織內(nèi)含有多種酚類物質(zhì)和多酚氧化酶，在加工過程中，由于組織破壞與空氣接觸，使酚類物質(zhì)被多酚氧化酶氧化，生成褐色的醌類物質(zhì)，從而影響外觀，也破壞了風(fēng)味和營養(yǎng)價值。這種褐變主要來源于酶促褐變，其關(guān)鍵作用的因子有酚類底物、酶和氧氣。為保留飲料中SOD酶活力，仙人掌不做漂燙護色處理。黃瓜進行漂燙和護色處理能夠鈍化酶，軟化組織，阻止葉綠素褪色和褐變，并提高出汁率。據(jù)文獻報道，黃瓜采用90℃熱燙3～5min，投入0.04%的醋酸鋅溶液（pH8.0）中護色15min，效果最佳。2.5仙人掌汁的澄清采取的澄清法是將制備好的黃瓜汁、仙人掌汁分別用磁力攪拌器攪拌30和60min（仙人掌汁含的果膠多，攪拌時間長，能充分破壞膠體結(jié)構(gòu)，使沉淀物快速地沉淀下來），移入4℃冰箱中自然澄清3～4h，取出濾除沉淀。此法結(jié)合自然澄清和冷凍澄清完成。利用此方法制成的飲料證明澄清效果比較滿意，飲料放置一段時間后并無沉淀出現(xiàn)。2.6采用冷殺菌工藝仙人掌SOD保健飲料，如用熱殺菌進行滅菌，將會導(dǎo)致仙人掌SOD酶活性喪失，所以不能采取傳統(tǒng)熱殺菌技術(shù)，需要采用冷殺菌工藝。生物體作為極性介質(zhì)吸收微波能量后使生物體的蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性凝固，從而達到殺菌目的，且對試驗條件要求低，可以作為仙人掌SOD保健飲料的殺菌方法。2.7化學(xué)成分飲料飲料中所添加的乙基麥芽酚和果糖，前者對苦澀有消殺作用，對特有風(fēng)味有“乳化作用”，具有抗菌，防腐性能；能有效延長食品儲存期；后者使風(fēng)味將更醇厚，有利于糖尿病患者和肥胖患者食用。制備的飲料口感細膩，具有仙人掌和黃瓜獨特的清香味；色澤青綠，無肉眼可見沉淀，其具有的SOD酶活力為2U/mL。3仙人掌黃瓜飲料制備工藝sod米邦塔食用仙人掌經(jīng)勻漿、硫酸銨鹽溶、鹽析、SephadexG-75凝膠層析等方法提取純化SOD，提取粗酶活力137.60