【文獻翻譯】四種青藏高原當地藥用作物果實多糖的抗疲勞活性

四種青藏高原當地藥用作物果實多糖的抗疲勞活性摘要：醫(yī)學相關性：沙棘果、枸杞、黑枸杞和柴達木唐古特白刺的果實是西藏地區(qū)的傳統(tǒng)藥用食品，在減輕由缺氧引起的疲勞等方面的應用已經有千年的歷史。本研究目標在于探索這四種來自青藏高原的標志性漿果中植物多糖的抗疲勞活性。原料和方法：沙棘果、枸杞、黑枸杞和柴達木唐古特白刺的果實收集于中國青海海西蒙古族藏族自治州（N36.321,E98.Ill；海拔高度：3100米），其多糖成分（HRWP,LBWP,LRWP,NTWP）通過熱水進行分離提取，通過DEAE纖維素離子交換層析法進行提純。分光光度法獲得碳水化合物、糖醛酸、蛋白質和淀粉多糖骨架。凝膠過濾層析測定多糖的分子質量。通過吡唑啉酮（PMP）柱前衍生高效液相色譜分析其單糖組分。每日給小鼠口服攝入HRWP、LBWP、LRWP和NTWP（劑量分別為50,100and200mg/kg）。采用負重游泳試驗（FST）、自動分析儀和市售試劑盒測定血清生化指標,稱量身體和器官重量,評估抗疲勞作用。結果：LBWP,LRWP和NTWP由葡聚糖和RG-I果膠組成，HRWP由HG型果膠和葡聚糖組成。這四種多糖都可延長負重游泳實驗中小鼠的竭力游泳時間，HRWP和LRWP比LBWP和NTWP的效果更明顯。對照組和實驗組的小鼠的肝臟和心臟指標無明顯區(qū)別，但是在LBWP和NTWP（200mg/kg）處理的小組中，小鼠的脾臟指標出現(xiàn)上升。此外，負重游泳實驗促使還原糖（Glc）、超氧化物歧化酶（SOD。及谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）水平降低，肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、血尿素氮（BUN）、甘油三酯（TG）及丙二醛（MDA）的水平升高。HRWP、LBWP、LRWP和NTWP在一定程度可抑制全部疲勞指標，同等劑量下，LBWP和NTWP的效果比HRWP和LRWP好。結論：四種青藏高原漿果植物中存在的水溶性多糖HRWP，LBWP，LRWP和NTWP可顯著增強抗疲勞活性。通過改變幾種酶活性，預防脂質氧化，保護紅細胞膜，影響運動過程中的甘油三酯（TG）（或脂肪）動員活動。研究表明，LBWP和NTWP比HRWP和LRWP更有效，適用于抗疲勞和抗氧化功能的功能性食品。1.引言疲勞最好的定義為發(fā)起或維持的自愿活動的困難，并可以分為精神疲勞和身體疲勞（Tanakaetal.,2008）。疲勞是影響物理性能的重要因素，常發(fā)生在衰老、癌癥、抑郁癥、艾滋病病毒感染、多發(fā)性硬化癥和帕金森氏病等多個因素中（Belluardoetal.,2001;Tharakanetal.,2006;Huangetal.2011。）迄今為止，有效治療疲勞的藥物或療法仍不能滿足人們的需要。因此，人們更注重尋求天然的抗疲勞化合物，而無副作用，提高運動能力，延緩疲勞（Kimetal.,2002;Uthayathasetal.,2007）近年來，藥用植物多糖被認為是一種新型的天然抗疲勞物質（Wangetal.,2010;ChenandZhang,2011;Shengetal.,2011;Huetal.,2012;Tanetal.,2012）。青藏高原，由于其高海拔和長日照，被稱為地球的第三極。在高原缺氧環(huán)境下，人很容易疲憊。所以，在藏藥體系中，很多原生植物和水果都用來減輕缺氧引起的疲勞（Maetal.,2011）。記錄在經典的藏藥理書“水晶珍珠綱目”漢語拼音是：jingzhubencao;Dierma,2012）的沙棘果，枸杞，黑枸杞和柴達木唐古特白刺都是幾千年來民間土生土長的抗疲勞藥物，是藏族傳統(tǒng)的藥用食物。最近的研究表明，沙棘果含有大量生物活性物質如維生素、類胡蘿卜素、植物甾醇、有機酸，多不飽和脂肪酸和一些必需氨基酸（Kanayamaetal.,2012）。枸杞果實和其多糖擁有一系列的生物活性，包括抗老化、神經保護、增加代謝、控制糖尿病患者血糖、緩解青光眼、抗氧化、免疫調節(jié)、抗腫瘤和細胞保護作用（AmagaseandFarnsworth,2011;Jinetal.,2013）。黑枸杞果實中含有豐富的花青素和高度支化的聚糖蛋白（Zhengetal.,2011;Pengetal.,2012）。柴達木唐古特白刺果實含有幾種生物堿和黃酮類物質包括尿囊素、MTCA和槲皮素（Wangetal.,2007;SuoandWang,2010）。然而，以往的研究主要集中在白刺、沙棘以及枸杞的小分子化合物的結構特征和藥理活性評價。即使多糖的研究熱點之一枸杞多糖，也缺乏對其抗疲勞活性分析。據我們所知，到目前為止，沒有關于四個青藏高原當地漿果植物的果實多糖抗疲勞活性的研究報告。在文中，將沙棘，枸杞、黑枸杞和白刺的水溶性多糖進行分離、純化并進行成分分析，測定抗疲勞和抗氧化活性，使用青藏高原特色漿果探索具有顯著抗疲勞作用的天然多糖。2.材料和方法2.1植物原料和化學試劑沙棘、枸杞、黑枸杞和白刺是從中國青海海西蒙古族藏族自治州都蘭各地收集（N36.321,E98.111;海拔高度：3100米）。材料是由中國西寧中國科學院西北高原生物研究所薛峰璐教授鑒定。標本館標本編號為HR20110805的沙棘、LB20110802的枸杞，LR20110719的黑枸杞和NT20110802的白刺，存放在青海省藏醫(yī)學藥理學與安全性評價重點實驗室。DEAE-纖維素柱及SepharoseCL-6B凝膠均購自Pharmacia公司。標準葡聚糖和單糖（半乳糖，阿拉伯糖，D-巖藻糖、鼠李糖，D-甘露糖、木糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸）購自從西格瑪公司（美國州的圣路易斯）。所有其他試劑均為分析純，中國制造。2.2實驗動物雄性BALB/c雄性小鼠（8周齡），采購自吉林大學藥理學實驗中心（長春，中國）。在實驗過程中，小鼠在室溫下處于一個12/12h光暗周期并可以自由獲取符合嚙齒動物食用標準的食物和水。動物處理程序符合美國國立衛(wèi)生研究院動物護理和使用指南。機構動物倫理委員會在實驗之前審查了整個動物協(xié)議。2.3多糖制備首先風干植物材料，然后在95%乙醇回流的下提取12h,完全去除疏水性化合物。這一步重復三次。過濾后通過一個紗布（100目），將殘留物在室溫下干燥，然后用熱水提?。?0°C,1:20w/v）三次（每次6小時）。獲得的水溶液混合、濃縮，隨后將95%乙醇添加到用離心法分離收集的含量高達80%的多糖濾液，進行真空干燥。沉淀物溶解在水中（5%W/V）,通過離心除去不溶性物質。上清液裝入DEAE-纖維素柱，然后用0.5MNaCl洗脫。收集洗脫液，濃縮至最小體積，透析，最后凍干得多糖。從青藏高原四個特色漿果中獲得水溶性多糖，分別從沙棘中提取HRWP,柴達木枸杞中提取LBWP，黑枸杞中提取LRWP和從白刺中提取NTWP。在每個多糖溶液中的內毒素水平小于0.5歐盟（內毒素單位）/毫升。分析方法以葡萄糖為標準，用硫酸苯酚法測定總糖含量（Duboisetal.,1956）。以半乳糖醛酸為標準，通過羥基聯(lián)苯比色法測定糖醛酸含量（BlumenkrantzandAsboeHansen，1973）。以托馬斯亮藍試劑與牛血清白蛋白作為標準，由SedmakandGrossberg（1977）法測定蛋白質含量。以可溶性淀粉為標準，根據Guretal.（1969）的方法測定淀粉含量。由瓊脂糖分子量分布凝膠CL-6B（85cm1.5i.d.）過濾層析。根據制造商的說明使用E-T0XATE檢測試劑盒（Sigma，圣路易斯，美國）分析污染物的內毒素鱟（LAL）。Hondaetal（1989）所描述的進行的單糖分析。簡單地說，將120C樣品（2mg）用2MCF3C00H（1.0ml）水解。水解產物（單糖）衍生的0.5M1-phenyl-3-methyl—5吡唑啉酮（PMP）和0.3MNaOH在中和0.3MHCl，PMP衍生物在Agilent1100分析配備AgilentEclipseXDB-C18柱高效液相色譜系統(tǒng)（250毫米4.6毫米，5“m）與一個保護柱通過在245納米的紫外吸收?？蛊趯嶒炘O計小鼠分為以下實驗組（6只小鼠/組）：完整組用生理鹽水處理，不進行游泳實驗（Mizoguchietal.,2011）；另一組用生理鹽水處理，并進行游泳實驗。實驗組給予不同劑量的多糖（HRWP、LBWP、LRWP和NTWP）（50,100和200mg/kg），并進行游泳實驗。小鼠口服多糖15天（上午7:00），最后一天復合給藥后1h進行負重游泳實驗。用乙醚麻醉小鼠，收集每個治療組的血液樣本。血清樣品3000g，離心10min，4C）存放在80C條件下進行下一步的分析。稱量脾臟、心臟和肝臟重量，計算最終的體重（器官）指標。2.6負重游泳實驗FST（負重游泳試驗，簡稱FST）和Porsoltetal.（1978）所描述的一樣。簡而言之，ICR小鼠單獨放置在玻璃瓶（高：25cm，直徑：10cm）,含有10cm水，在23-25°C下，6分鐘一組。在實驗結束時，將小鼠從水里取出，用紙巾擦干，放在的籠子里。每組實驗后容器中的水都有改變。力竭時間是由一個受過訓練的實驗人員手動記錄，未知的實驗條件下，在最后4分鐘的測試期間，力竭的定義是當老鼠不再掙扎，在水里漂浮不動，只做那些保持他們的頭在水上的動作。2.7血清檢驗在小鼠腹腔注射氯胺酮麻醉（80mg/kg）和甲苯噻嗪（4毫克/公斤）。麻醉后，血液從負重游泳小鼠的心臟注入。然后，血清通過3000轉速在4C10分鐘離心分離法制備。內容物由葡萄糖（Glc）、血清乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、甘油三酯（TG）的自動分析儀測定（日立7060、日立、日本）。血中尿素氮（BUN）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）通過從建成生物工程研究所的市售試劑盒測定（南京，中國）。2.8統(tǒng)計分析統(tǒng)計分析顯著性由單因素方差分析和Dunnett's事后比較確定。所有的值表示為P<0.05，被認為是顯著的。3.結果與分析3.1藥用漿果多糖分析通過熱水提取和80%乙醇溶液沉淀，從沙棘、枸杞、黑枸杞和白刺果實中分離出四種多糖組分，分別被命名為HRWP，LBWP，LRWP和NTWP。HRWP是黃褐色粉末，占沙棘果干重的5.5%；LBWP是淺棕色粉末，占枸杞果實干重的4%；LRWP是深褐色的粉末，占黑枸杞干重的10.3%；NTWP是淺棕色粉末，占白刺果實干重的4.8%。四種多糖組分的碳水化合物含量通過苯酚-硫酸法確定95%以上。由于采用DEAE-纖維素離子交換層析法去除蛋白多糖組分，蛋白質含量低于1.2%。其紫外光譜沒有在260納米處的峰，這表明，不含核酸。Limulusamebocytelysate（LAL）檢測顯示小于0.05歐盟/毫克，這表明結果為負。總糖、糖醛酸、蛋白質、淀粉含量和各多糖產量列于表1，其單糖組成和分子量分布在圖1和表2。結果表明LBWP，LRWP和NTWP分子主要由葡聚糖組成，在缺失淀粉的情況下，葡聚糖不是a-(1,4)或a-(1,6)糖苷鍵連接，還包括一些鼠李糖和半乳糖醛酸。為確定LBWP的RHA/半乳糖醛酸的比率，LRWP和NTWP分別為0.33，0.21和0.38，其中，在鼠李半乳糖醛酸I(RG-I)的范圍從0.05到IScholsandVoragen(1996)。這表明他們可能含有果膠RG-I。RG-I已記載是由a-(1,4)與D-半乳糖醛酸和a-(1,2)連接的鼠李糖，相間相互結合的骨干是一些含有鼠李糖殘基側鏈，如阿拉伯聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖在4-O-鼠李糖(McNeiletal.,1980)。因此，我們推斷，上述多糖組分中的半乳糖和阿拉伯糖的可能是由阿拉伯聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖，以非共價形式或作為側鏈的RG-I域相關RG-I構成。然而，他們的結構需要進一步的研究。HRWP的Rha/GalUA比被確定為0.02，這低于RG-I范圍的下限，表明HRWP半乳糖醛酸可能主要是a-(1,4)糖苷鍵連接的半乳糖醛酸聚糖(HG)型果膠(ScholsandVoragen,1996)。除了半乳糖醛酸，HRWP也包含一些其他糖類。淀粉含量的測定表明，HRWP中的葡萄糖不以a-(1,4)或a-(1,6)糖苷鍵形式相連，因此葡聚糖是非淀粉的性質。根據它的洗脫曲線可以推斷，HG型果膠可能存在于高分子量化合物，目前的葡聚糖較低。這一推論需要在我們進一步的研究中得到驗證。多糖在負重游泳試驗中的影響已被廣泛用于進行抗疲勞功能性評估的負重游泳試驗，評價這四個多糖抗疲勞活性(DubovikandBogomazov,1987;Ozturketal.,2002)不動時間表明疲勞程度(Tanakaetal.,2003)。正如預期的那樣，生理鹽水處理與四種多糖降低小鼠的不動時間的FST的比較(圖2)。然而,50mg/kg的LBWP,LRWP和NTWP的影響被證明,HRWP減少在100mg/kg(P〈0.05)。而在100和200mg/kg，表明LBWP、NTWP具有極為顯著性(p〈0.01),同時表明LBWP和NTWP相比于LRWP和HRWP有更好的抗疲勞能力。在這些數據中的差異可能是由于多糖組合物和結構導致。LBWP，LRWP和NTWP主要含有大量的葡萄糖是由葡聚糖。以往的研究表明，不同類型的a-(1,3)，(1,4)，a-(1,4)，(1,6)或B-(1-3)(1-6)鍵葡聚糖具有明顯的生物活性，包括免疫和抗氧化作用(BrownandGordon,2001;Nairetal.,2006;Liuetal.,2007;Nietal.,2010;Gaoetal.,2011;Bietal.,2013)，其中涉及抗疲勞作用(Shinetal.,2005;Dingetal.,2011)。同時，HRWP含有大量的半乳糖醛酸，半乳糖醛酸可能由HG型果膠通過a-(1,4)鍵連結。因此，有可能是HG型的果膠抗疲勞能效低于葡聚糖。多糖對器官重量的影響體重記錄在實驗前(初始)和2周后(最終)，計算體重增加。如表3所示，所有四種藥用多糖對體重和體重增加無明顯影響，與對照組相比，體重增加，肝、心、脾重量下降的關系需要進一步評估?？诜﨟RWP，LBWP，NTWP和LRWP，50、100和200mg/kg連續(xù)兩周，略有下降，但不顯著，可減輕受試小鼠心臟重量比。運動的能量最初來自糖原的分解，眾所周知，運動后血糖水平會立即下降(Dorchy,2006）。生理鹽水處理的小鼠的肝重量略有下降，但不顯著，與完整組相比有減少。然而，四多糖在一定程度上增加肝/臟重量比。因為脾是一個免疫功能相關的器官，這些結果表明身體疲乏和免疫抑制的關系。有趣的是，補充的多糖可能會導致在慢性疲勞，阻礙細胞增殖與恢復。在200mg/kg的LBWP和NTWP表現(xiàn)出比完整組有了極大提高。多糖對血清生化指標的影響為了闡明其作用機制，測定負重游泳小鼠血液生化指標。如表4所示，負重游泳試驗導致尿素氮、TG、CK、LDH和與血清MDA水平比完整組增加高。這些影響是通過部分阻礙HRWP,LBWP,LRWP和NTWP發(fā)揮作用，在多糖劑量為200mg/kg時恢復到平均水平。重要的是，這些影響被LBWP和NTWP阻塞，但在劑量（50mg/kg）比其他兩種多糖低（100mg/kg）。相比之下,在負重游泳試驗降低GLC,SOD和GPX水平。值得注意的是，所有的這些影響是由于HRWP，LBWP，LRWP和NTWP受阻，但LBWP劑量（100mg/kg）比其他三個化合物的低。這些多糖抗疲勞的機制可能包括兩個方面。一種可能的解釋是，緩解疲勞過程包括在運動過程中進行甘油三酯（TG）多糖（或脂肪）動員，如在TG和BUN水平下降，同時增加表明葡萄糖（GLC）水平。眾所周知，血糖水平在運動后立即下降，隨后是非酯化脂肪酸釋放葡萄糖的循環(huán)（Dorchy,2006）。這種影響可能會在長時間的運動成為有利因素，因為可以更好的利用TG允許保留糖原和葡萄糖，因此延遲疲勞（Jungetal.,2004）。對于這些多糖抗疲勞作用的另一個可能的解釋是它發(fā)生可能通過紅細胞膜的保護，通過修改幾種酶活性預防脂質氧化。疲勞導致活性氧（氧）釋放，導致膜結構的脂質過氧化。在疲勞的情況下，增加MDA水平和伴隨著的抗氧化酶SOD和GPX水平下降（Lenaz,1998）。這些條件也為血清LDH和CK的釋放明顯，作為膜結構損傷的間接指標（Passarellaetal.,2008）。值得注意的是，這四個多糖藥理情況在不同劑量進行的實驗，但在較低的劑量LBWP和NTWP的抗疲勞效果比其他兩種多糖更差。4.結論從四種青藏高原土著漿果植物果實中分離出的四種水溶性多糖，包括沙棘中的HRWP，枸杞中的LBWP，黑枸杞中的LRWP和白刺中的NTWP。我們的第一次抗疲勞研究結果顯示，四種多糖的活性，通過在運動過程中甘油三酯（甘油三酯）（或脂肪）動員，通過修改幾種酶的活性防止保護紅細胞膜脂質氧化。此外，它表明，LBWP和NTWP比HRWP和LRWP更有抗疲勞效果，具有用于抗疲勞和抗氧化功能食品的潛力。然而，這些多糖的免疫學、結構和抗疲勞活性之間的關系，需要進一步討論。感謝這項工作是由青海省自然科學基金會（2011-z-930q）,“西部之光”人才培養(yǎng)工程，中國科學院知識創(chuàng)新工程項目（kscx2-yw-r-216）和國家科技攻關項目、中國科學技術部（2012bai27b05）資助的。表1四種藥用漿果多糖組分的產量'總碳水化合物'糖醛酸'蛋白質以及淀粉含量成分產量a（%）總碳水化合物含量b（%）糖醛酸含量c（%）蛋白質含量d（%）淀粉含量e（%）HRWP5.595.261.81.30.01LBWP1497.51.90.010.01LRWP10.396.83.30.030.01NTWP4.8982.61.90.02基于干燥的材料質量計算產率。通過使用葡萄糖作為標準的苯酚-H2SO4方法測定總碳水化合物含量。通過間羥基二苯基比色法測定糖醛酸含量，使用半乳糖醛酸作為標準。蛋白質含量根據Sedmak和Grossberg（1977）的方法，用考馬斯亮藍試劑和牛血清白蛋白作為標準。淀粉含量測定根據Gur淀粉含量測定根據Gur等人的方法（1969），使用可溶性淀粉作為標準。e.圖1.SepharoseCL-6B洗脫曲線的四種藥物-食物漿果的多糖級分：A,HRWP;B,LBWP;C,LRWP和D,NTWP

表2.來自四種藥用食品漿果的多糖級分的分子量分布，單糖組分和可能類型的多糖組分成分Mw（kD）單糖組分a%）多糖組分種類bManRhaClcUACalUAGlcGalXylAraHRWP194.2,W10.04.21.30.759.420.19.71.13.5同聚半乳糖醛酸和葡聚糖LBWPW10.02.10.6n.d.1.986.83n.d.5.6葡聚糖和鼠李半乳糖醛酸LRWP￡1000.0,78.7,9.41.61.2n.d.5.782.32.90.76.2葡聚糖和鼠李半乳糖醛酸±1000.0,79.7,WNTWP10.03.91.80.23.370.67.6n.d.13葡聚糖和鼠李半乳糖醛酸在甲醇分解后與CF3COOH水解結合，隨后通過PMP-前柱衍生獲得的糖-1-苯基-3-甲基-5-毗唑啉酮（PMP）衍生物，并通過HPLC分析。多糖組分的類型根據單糖組成和Rha/GalUA的比率推導。圖2.多糖部分對FST中不動性的影響。不動產在完整組或多糖中在FST中記錄4分鐘的時間。值是表示為平均值土SEM。每組n=6，a，b和c表示顯著性差異。組。aP〈001,bP〈.O1,cP〈.O5。表3.多糖組分對小鼠體重和器官指數的影響劑量組別(mg/kg)體重（g）器官指數第1天第15天肝臟心臟脾臟空白組022.1±1.128.1±3.94.4±0.30.5±0.10.4±0.03p.s.021.5±2.227.4±3.44.1±0.20.4±0.060.4±0.09HRWP5018.2±2.826.8±4.24.1±0.30.4±0.070.5±0.0810020.1±3.230.0±2.95.3±0.30.5±0.040.5±0.0920019.8±3.528.8±4.25.8±0.20.5±0.080.5±0.06LBWP5020.7±2.927.2±3.35.3±0.40.5±0.090.6±0.0510021.3±2.429.4±4.75.1±0.20.4±0.020.6±0.0220021.5±3.929.3±3.75.1±0.60.5±0.090.6±0.01LRWP5019.9±4.030.2±3.55.0±0.50.4±0.040.4±0.0210020.2±2.332.0±5.15.1±0.10.4±0.050.5±0.01

20021.1±4.333.9±4.35.4±0.40.5±0.090.4±0.03NTWP5019.4±3.327.3±3.15.4±0.50.4±0.030.5±0.0410019.3±3.229.0±3.34.9±0.30.4±0.060.5±0.0320021.3±3.128.1±4.25.8±0.10.5±0.050.6±0.04數據表示為平均值土SEM。(n=6),a和b表示與p.s?的顯著差異組。器官指數二器官重量/體重X100o空白組二暴露于FAST并用鹽水處理的小鼠，p.s二暴露于FST并用鹽水處理的小鼠。P<0.01P<0.05表4負重游泳試驗后多糖級分對血清生化指標的影響劑量組別(mg/kg)Glc(mmol/L)BUN(mmol/L)TG(mmol/L)CK(U/L)LDH(U/L)MDA(nmol/mL)SOD(U/mL)GPx(U/L)空1001白10.2±9.1±±620±16.4±131.43676±組01.1b2.8c2.3±0.2220a33.0b2.2a±20.421a對照10.1±1314847±96.8±495±組08.8±2.22.42.5±0.1±11416.222.5±1.733.9331229HRW10.