一種達托霉素的提取純化方法

如權(quán)利要求1所述的提取純化方法，其特征是所述的：1）、富集：A、在含有達托霉素的發(fā)酵液中投入大孔吸附樹脂，吸附后收集樹脂，裝入解吸柱中；B、用含低分子醇濃度低于50%且含有1-5%鹽的水溶液pH6-7進行解吸；C、用含低分子醇濃度高于50%的水溶液洗脫解吸柱，收集解吸液；D、解吸液納濾濃縮；2）、粗提?。篈、酸性柱層析：調(diào)濃縮液pH至中等酸性；上柱后用40-55%的低分子醇濃度水溶液階梯梯度洗脫；納濾濃縮；B、中性柱層析：調(diào)濃縮液pH至中性，向濃縮液中加入1-5%鹽；上柱后用含30-45%低分子醇且含1-5%鹽的水溶液洗脫，洗脫量為樹脂柱體積的3~4倍；用20-30%低分子醇水溶液洗脫，收集洗脫流分；調(diào)pH至中性；納濾機濃縮；3）、精制：A、中性柱層析：濃縮液中加入1~5%鹽，調(diào)整濃縮液pH中性；上柱后用5%低分子醇水溶液洗脫層析柱，洗脫量為柱體積的6-9倍；用10-20%低分子醇水溶液洗脫，洗脫量為柱體積的8-13倍，收集洗脫流分；收集的流分調(diào)pH至中性；用HPLC法檢測所收集的流分，合并達托霉素歸一化含量大于等于92%的流分，納濾機濃縮；B、酸性柱層析：調(diào)濃縮pH至中等酸性；上柱后，采用低分子醇和揮發(fā)性酸水溶液組成的混合洗脫劑進行線性梯度洗脫，洗脫量3~6倍柱體積時開始收集，在洗脫量達到8~14倍柱體積時停止洗脫；合并達托霉素歸一化含量大于等于95%的流分；4）、凍干：冷凍干燥至粉末后，在20r?30°C，壓力低于10Pa的條件下干燥2~5小時，得成品。如權(quán)利要求2所述的達托霉素的提取純化方法，其特征是所述的步驟1）中的大孔吸附樹脂為HZ818、X-5、HZ804、HZ816中的任一種；步驟2）的中的層析柱填料為PRP512、C18、或C8中的任一種，步驟3）層析柱的填料選用C18或C8。如權(quán)利要求2所述的達托霉素的提取純化方法，其特征步驟1）中是所述的解吸劑為甲醇、乙醇、丙醇或丁醇中的任一種。如權(quán)利要求4所述的達托霉素的提取純化方法，其特征是所述的解吸劑為乙醇。如權(quán)利要求2所述的達托霉素的提取純化方法，其特征是所述的鹽為氯化鈉、乙酸銨中的任一種。如權(quán)利要求2所述的達托霉素的提取純化方法，其特征是所述的步驟2）A中的洗脫為先以40%的低濃度乙醇水溶液洗脫，用量為柱體積的2~4倍；再換成45±2%的乙醇水溶液洗脫，用量為柱體積3~5倍，最后用55%的乙醇水溶液洗脫，用量為柱體積3~5倍。如權(quán)利要求2所述的達托霉素的提取純化方法，其特征是所述的酸性層析中上柱液調(diào)pH的酸為鹽酸、硫酸、磷酸、丙酸、草酸、甲酸或乙酸中的任一種或幾種。如權(quán)利要求8所述的達托霉素的提取純化方法，其特征是所述的酸為磷酸或甲酸。如權(quán)利要求2所述的達托霉素的提取純化方法，其特征是所述的中性柱層析中上柱液調(diào)pH的堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀中任一種。一種達托霉素的提取純化方法技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明屬藥物化學領(lǐng)域，具體涉及一種達托霉素的提取純化方法。[0002]背景技術(shù)[0003]達托霉素是一類稱為環(huán)酯肽類新抗生素家族的第一個產(chǎn)品。它是從小鏈霉菌

（Streptomycesparvus）發(fā)酵液當中提取得到的十三個氨基酸組成的結(jié)構(gòu)新穎的環(huán)脂肽類抗生素，其中十個氨基酸構(gòu)成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在環(huán)外癸酸和色氨酸發(fā)生酯化。它不僅具有新穎的化學結(jié)構(gòu)，且其作用模式也與任一已獲準抗生素不同。它能在多個方面破壞細菌細胞膜功能，由此迅速殺死革蘭陽性菌。達托霉素除能作用于大多數(shù)臨床相關(guān)革蘭陽性菌外，更重要的是在體外對已呈甲氧西林（methicillin）.萬古霉素和利奈唑胺等耐藥性分離菌株仍具強力活性。[0004]達托霉素為發(fā)酵產(chǎn)物，通過發(fā)酵培養(yǎng)得到的發(fā)酵濾液，發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量的色素及與達托霉素結(jié)構(gòu)相近似的副產(chǎn)物如脫水達托霉素，因此達托霉素的提取純化方法較復雜。一般達托霉素產(chǎn)生菌，生產(chǎn)能力不穩(wěn)定，產(chǎn)量較低，發(fā)酵副產(chǎn)物較多，雜質(zhì)較多，導致后提取工作較為復雜，大大地增加了后序的提純難度，難以獲得高純度的最終產(chǎn)物，從而無法產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。[0005]對達托霉素后序的提取純化方法已經(jīng)有不少文獻報導，比如安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司申請的《一種高純達托霉素的制備方法》（申請?zhí)?00910085837.X）,它公開的大致工藝為：發(fā)酵液經(jīng)超濾、納濾、陽離子樹脂吸附酸洗、陰離子樹脂中和，納濾濃縮、結(jié)晶。膜過濾收率達到98—99%，產(chǎn)品經(jīng)結(jié)晶后純度也能得到98.5%以上。但達托霉素是個兩性物質(zhì)，等電點約是pH4-5,在不同的pH條件下，它的溶解性是不同的，尤其是達托霉素存在有大量的同系物、異構(gòu)體，這些雜質(zhì)在性質(zhì)上與達托霉素很相似，因此，通過這么簡單的工藝，在產(chǎn)業(yè)上要分離純化甚至結(jié)晶達托霉素是很困難的。[0006]成都雅途生物技術(shù)有限公司申請的專利《一種高純度達托霉素的純化制備方法》（申請?zhí)?00910058577.7），該發(fā)明公開了運用一種反相硅膠材料把粗品精制成高純度的達托霉素。該方法僅是達托霉素粗品的精制，而沒有公開如何從發(fā)酵液制得成品。[0007]而達托霉素的原研公司美國卡比斯特制藥公司申請的專利《高純度脂肽、脂肽膠束及其制備方法》（申請?zhí)?1805212.6及其分案200810087401.X）公開了利用陰離子樹脂除去脫水達托霉素和0-異構(gòu)，運用改良緩沖液-尿素洗脫樹脂，大致工藝：發(fā)酵液經(jīng)丁醇萃取，用陰離子樹脂吸附解吸，疏水相互作用色譜層析，再用陰離子交換色譜法進行反復層析得到高純度的達托霉素。整個制備過程涉及的方法較多：萃取、離子交換、色譜層析、納濾、超濾等，尤其是萃取涉及的溶媒量較多，對生產(chǎn)保護和人身安全均不利?？ū人固刂扑幑玖硪粚＠吨苽浼兓牡姆椒ā罚ㄉ暾?zhí)?1821937.3），公開了運用結(jié)晶的方法來純化達托霉素，但得到是達托霉素含有鈣離子，并非用于制備注射用達托霉素的原料，且其所公開的試驗內(nèi)容均為毫克級，與產(chǎn)業(yè)化距離很大，無法直接放大工業(yè)生產(chǎn)。[0008]文獻資料《達托霉素發(fā)酵液大孔樹脂吸附分離的研究》（中國抗生素雜志2008年2月第33卷第2期）介紹了達托霉素發(fā)酵液運用大孔樹脂富集的方法。[0009]這三份文獻公開的達托霉素的提取純化方法都存在操作步驟復雜，發(fā)酵液色素和雜質(zhì)難去除，最終產(chǎn)品色澤深和純度不高等問題；而且，不同菌種發(fā)酵產(chǎn)生的不同發(fā)酵液不一定能用相同的提取方法。[0010]因此尋找更有效的脫色方法和更簡便的提取純化方法，才有可能實現(xiàn)達托霉素的工業(yè)化生產(chǎn)。發(fā)明內(nèi)容[0011]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的達托霉素的提取純化工藝復雜，提純工藝難以產(chǎn)業(yè)化的缺陷，提供有效方法去除達托霉素中的色素，提高達托霉素的含量，并可適用于工業(yè)化大生產(chǎn)的方法。[0012]本發(fā)明提供了一種達托霉素的提取純化方法，主要包括富集發(fā)酵液中的達托霉素、富集得到的達托霉素粗提取、達托霉素的精制、凍干幾個步驟。[0013]其中，粗提取先采用酸性柱層析，再用中性柱層析，這樣的工藝操作可以去除發(fā)酵

液中存在的大部分的色素，降低部分雜質(zhì)，如HPLC圖譜中主峰之后（RRT>1）和主峰之前（RRT<1）的雜質(zhì)。其中所述的酸性柱，是指將欲層析的溶液和洗脫劑調(diào)至酸性，優(yōu)選為中等酸性，如pH為2至4左右；該步有效的降低雜質(zhì)，提高達托霉素的含量。中性柱層析是指將欲層析的溶液調(diào)至中性，如pH為6至8左右，洗脫劑pH自然，該步層析對RRT>1的后雜質(zhì)降低有效。[0014]在精制時，采用中性層析和酸性層析來提純達托霉素，但該階段的層析主要是降低或減少粗提取過程中無法降低或去除的雜質(zhì)。其中中性柱層析的主要目的是達到去除達托霉素HPLC圖譜中主峰之后的如脫水達托霉素等雜質(zhì)（RRT>1），酸性柱層析以去除達托霉素HPLC圖譜中主峰之前的雜質(zhì)（RRT<1），其中所述的中性柱是指將欲層析的溶液調(diào)至中性，如pH為6至8左右；該步層析可以進一步的減少色素，降低雜質(zhì)脫水達托霉素的含量；酸性柱層析是指將欲層析的溶液和洗脫劑調(diào)至酸性，優(yōu)選為中等酸性，如pH為2至4左右。[0015]為了達到更好的提取純化效果，本發(fā)明的提取純化方法優(yōu)選：1）、發(fā)酵液中達托霉素的富集：A、在含有達托霉素的發(fā)酵液中投入大孔吸附樹脂，吸附后收集樹脂，裝入解吸柱中；B、用含低分子醇濃度低于50%且含有1-5%鹽的水溶液pH6-7進行解吸；C、用含低分子醇濃度高于50%的水溶液進行解吸，收集解吸液；D、解吸液納濾濃縮；2）、粗提取：A、酸性柱層析：調(diào)濃縮液pH至中等酸性（pH2-4）；上柱后用40-55%的低分子醇濃度水溶液（pH2-4）階梯梯度洗脫；納濾濃縮；B、中性柱層析：調(diào)濃縮液pH至中性，向濃縮液中加入1-5%鹽；上柱后用含30-45%低分子醇且含1-5%鹽的水溶液洗脫，洗脫量為樹脂柱體積的3~4倍；用20-30%低分子醇水溶液洗脫，收集洗脫流分；調(diào)pH至中性；納濾濃縮；3）、精制：A、中性柱層析：濃縮液中加入1~5%鹽，調(diào)整濃縮液pH中性；上柱后用5%低分子醇水溶液洗脫層析柱，洗脫量為柱體積的6-9倍；用10-20%低分子醇水溶液洗脫，洗脫量為柱體積的8-13倍，收集洗脫流分；調(diào)pH至中性；用HPLC法檢測所收集的流分，合并達托霉素歸一化含量大于等于92%的流分，納濾濃縮；B、酸性柱層析：調(diào)濃縮液pH至中等酸性；上柱后，采用低分子醇和揮發(fā)性酸水溶液組成的混合洗脫劑進行線性梯度洗脫，洗脫量3~6倍柱體積時開始收集，在洗脫量達到8~14倍柱體積時停止洗脫；合并達托霉素歸一化含量大于等于95%的流分；4）、凍干：冷凍干燥至粉末后，在20r?30°C，壓力低于10Pa的條件下干燥2~5小時，得成品。[0016]其中，“含低分子醇濃度低于50%且含有1-5%鹽的水溶液”，是指水溶液中低分子醇濃度低于50%，并且中還含有1-5%鹽。在本申請文件中所提及的類似的水溶液中醇和/或鹽的濃度，均依以上解釋。[0017]其中所述的步驟1）中的大孔吸附樹脂為HZ818、X-5、HZ804、HZ816中的任一種；步驟2）的中的層析柱填料為PRP512、C18、C8中的任一種，步驟3）層析柱的填料選用C18或C8。[0018]其中步驟1）中的解吸劑為為甲醇、乙醇、丙醇或丁醇中的任一種，優(yōu)選乙醇。[0019]其中所述的鹽為氯化鈉、乙酸銨中的任一種。[0020]其中所述的步驟2）A中的洗脫為先以40%左右的低濃度乙醇水溶液洗脫，用量為柱體積的2~4倍；再換成45%左右的乙醇水溶液洗脫，用量為柱體積3~5倍，最后用55%左

右的乙醇水溶液洗脫，用量為柱體積3~5倍。洗脫劑可以運用工業(yè)級試劑，采用階梯梯度洗脫。[0021]其中所述的步驟2）A中的收集為從45%左右的乙醇水溶液洗脫開始。[0022]其中酸性層析中上柱液調(diào)pH的酸為鹽酸、硫酸、磷酸、丙酸、草酸、甲酸或乙酸中的任一種或幾種，優(yōu)選磷酸或甲酸。[0023]其中所述的中性柱層析中上柱液調(diào)pH的堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀中任一種。[0024]更具體地說：雖然現(xiàn)有技術(shù)中也有一些發(fā)酵液的富集方法，但其產(chǎn)業(yè)化效果不佳。比如采用“中國抗生素雜志2008年2月第33卷第2期”《達托霉素發(fā)酵液大孔樹脂吸附分離的研究》中的方法。此方法中采用動態(tài)吸附的方法，工業(yè)化生產(chǎn)中發(fā)酵液經(jīng)過板框過濾，濾液上樹脂柱吸附，而板框過濾有一部分達托霉素會被菌渣包裹難以濾出，導致板框收率最高也只有85?90%，濾液再進行樹脂柱吸附過程中濾液逐漸有一些雜質(zhì)聚集成絮狀物會堵住樹脂柱，影響樹脂柱解吸的效果，因而整個過程的收率會受影響。[0025]本發(fā)明對富集的方法進行改良，采用將樹脂加入發(fā)酵液中進行攪拌吸附試驗，減少板框操作及板框過濾收率的影響，又可以快速將達托霉素從發(fā)酵液中進行富集，不至于樹脂柱堵塞。通過試驗，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)吸附濾液中達托霉素的殘留量較少，因此發(fā)酵結(jié)束時，可以按照10?20%發(fā)酵液的量加入樹脂，同時加入3%左右的鹽較為合適。[0026]在整個生產(chǎn)過程中，收集的解吸液、洗脫流分可經(jīng)過減壓濃縮、納濾濃縮，優(yōu)選納濾濃縮方法，這種不加熱的濃縮方法更適合達托霉素的工業(yè)化生產(chǎn)，減少由加熱引起的達托霉素的降解破壞。[0027]此外，在步驟1）中通過將樹脂直接投入發(fā)酵液中攪拌吸附，簡化達托霉素的富集過程，減少由板框過濾過濾帶來的損失，增加富集收率。[0028]在粗提取和精制過程都采用酸性層析和中性層析是因為pH不同在層析過程中可以去除不同的雜質(zhì)，在兩個不同階段都采用酸性層析和中性層析是為了將雜質(zhì)盡可能的降到最低。[0029]中性層析的收集液pH較高，需將pH調(diào)到中性，是因為達托霉素在pH大于9的溶液中很不穩(wěn)定，會導致達托霉素分解開環(huán)，雜質(zhì)上升。[0030]本發(fā)明所公開的提取純化工藝，通過優(yōu)化提取純化的各個步驟，使本工藝的生產(chǎn)成本低，工藝步驟簡單，易于工業(yè)化生產(chǎn)，同時所得到的達托霉素提取純化過程中脫色效果明顯，產(chǎn)物純度高。[0031]具體實施方式[0032]以下所有實施例中所涉及的達托霉素發(fā)酵液以中國專利《一種小鏈霉菌及其在達托霉素制備中的應(yīng)用》（申請?zhí)?01010225330.2）實施例6所述的方法制備得到。[0033]實施例1:達托霉素的富集吸附對比試驗：樹脂均為上海華震科技有限公司的大孔吸附樹脂HZ818。[0034]1）、采用文獻資料“中國抗生素雜志2008年2月第33卷第2期”《達托霉素發(fā)酵液大孔樹脂吸附分離的研究》所述的方法，進行試驗。[0035]樹脂預處理：丙酮充分浸泡樹脂，除去色素和雜質(zhì)，用蒸餾水洗滌，至洗滌液加丙酮不變渾為止。然后用4倍樹脂體積的1mol/LHCl溶液浸泡3h,除去堿性物質(zhì)，蒸餾水洗至中性。再用4倍樹脂體積的1mol/LNaOH溶液浸泡3h,除去酸性物質(zhì)，洗至中性備用。[0036]取達托霉素發(fā)酵濾液200ml,含達托霉素139mg，已處理好的樹脂20ml,濕法裝入玻璃樹脂柱（徑高比1：10）,常溫下以流速160ml/min上樣，采用動態(tài)吸附的方法，吸附時保證樹脂吸附飽和或過飽和，并用無鹽水以同樣流速洗滌樹脂柱1h,將樹脂間隙未吸附的料

液洗滌下來，合并下柱液及水洗液。[0037]經(jīng)檢測：下柱液及水洗液含達托霉素17.24mg，吸附率87.6%。[0038]2）、取達托霉素發(fā)酵液200ml,含達托霉素139mg，加入如前處理好的樹脂20ml,氯化鈉3g,吸附1h,保證樹脂吸附飽和或過飽和。過篩，用氯化鈉鹽水溶液清洗樹脂，合并吸附余液和鹽水洗液。[0039]經(jīng)檢測：吸附余液和鹽水洗液中含達托霉素13.8mg，吸附率90.1%。[0040]3）、取達托霉素發(fā)酵液200ml,含達托霉素139mg，加入如前處理好的樹脂40ml,乙酸銨6g,吸附2h,保證樹脂吸附飽和或過飽和。過篩，用氯化鈉鹽水溶液清洗樹脂，合并吸附余液和鹽水洗液。[0041]經(jīng)檢測：吸附余液和鹽水洗液中含達托霉素8mg，吸附率94.2%。[0042]實施例2、粗提取、精制1）、粗提?。篈、酸性柱層析：濃縮液40升，353克，純度70%，顏色深棕色，前雜質(zhì)RRT<1為11.93%，后雜質(zhì)RRT>1為17.14%，用甲酸調(diào)pH至2；上樹脂PRP512柱后用40%pH值2.5的的甲醇濃度水溶液洗脫；收集洗脫流分，調(diào)pH至6,濃縮后20升，230g,純度85%，顏色棕色，前雜質(zhì)RRT<1為6.33%，后雜質(zhì)RRT>1為5.24%，收率為65.4%。[0043]B、中性柱層析：濃縮液20升，用氫氧化鈉調(diào)pH至6左右，加氯化鈉3%左右；上樹脂PRP512柱后用含20%甲醇洗脫，收集洗脫流分；收集的流分用甲酸調(diào)pH至6左右；濃縮，5升；顏色淺棕色，144g,純度88%，前雜質(zhì)RRT<1為5.81%，后雜質(zhì)RRT>1為2.79%o[0044]2）、精制：A、中性柱層析：濃縮液5升，純度88%，濃縮液用甲酸調(diào)pH至6左右；上C8柱后，用10%甲醇水溶液洗脫，收集洗脫流分；收集的流分用氫氧化鈉調(diào)pH至6；用HPLC法檢測所收集的流分，合并達托霉素歸一化含量大于等于92%的流分，濃縮，3.5升；89g，雜質(zhì)脫水達托霉素由層析前的2.15%降至0.51%，除脫水達托霉素外RRT>1為0.79%,顏色為黃色。[0045]B、酸性柱層析：用甲酸調(diào)濃縮液pH至2左右；上C8柱后，采用甲醇和甲酸水溶液組成的混合洗脫劑進行線性梯度洗脫，洗脫量3~6倍柱體積時開始收集，在洗脫量達到8~14倍柱體積時停止洗脫；合并達托霉素歸一化含量大于等于95%的流分；濃縮凍干得到樣品，收率70.7%，純度達到98.5%,RRT<1為1.02%，顏色淺黃色。[0046]實施例3、粗提取、精制1）、粗提取：A、酸性柱層析：濃縮液400升，3500克，純度68.5%，顏色深棕色，前雜質(zhì)RRT<1為12.05%，后雜質(zhì)RRT>1為16.75%，用乙酸調(diào)pH至4；上C8柱后用40%的pH值2.7的乙醇濃度水溶液洗脫；收集洗脫流分，調(diào)pH至8,濃縮后100升，2180g，純度83%，顏色棕色，前雜質(zhì)RRT<1為6.67%，后雜質(zhì)RRT>1為6.85%，收率為62.3%。[0047]B、中性柱層析：濃縮液100升，用氫氧化鉀調(diào)pH至6左右，加氯化鈉3%左右；上C8柱后用含30%甲醇洗脫，收集洗脫流分；收集的洗脫流分用甲酸調(diào)pH至6左右；濃縮，10升；顏色淺棕色，1405g,純度90%，前雜質(zhì)RRT<1為5.52%,后雜質(zhì)RRT>1為3.09%o[0048]2）、精制：A、中性柱層析：濃縮液10升，純度90%，濃縮液用甲酸調(diào)pH至8左右；上C18柱后，用10%乙醇水溶液洗脫，收集洗脫流分；收集洗脫流分用氫氧化鉀調(diào)pH至6；用HPLC法檢測所收集的流分，合并達托霉素歸一化含量大于等于92%的流分，濃縮，6升；850g，雜質(zhì)脫水達托霉素由層析前的3.09%降至0.62%，除脫水達托霉素外RRT>1為0.51%,顏色為黃色。

[0049]B、酸性柱層析：用甲酸調(diào)濃縮液pH至2左右；上柱后，采用乙醇和乙酸水溶液組成的混合洗脫劑進行線性梯度洗脫，洗脫量3~6倍柱體積時開始收集，在洗脫量達到8~14倍柱體積時停止洗脫；合并達托霉素歸一化含量大于等于95%的流分；濃縮凍干得到樣品，收率67.4%，純度達到98.2%,RRT<1為1.17%，顏色淺黃色。[0050]實施例4:1）、發(fā)酵液中達托霉素富集：A、發(fā)酵液中達托霉素的吸附：發(fā)酵液5000L含達托霉素7600g攪拌狀態(tài)下加入150kg氯化鈉和500L（10%）的X-5樹脂，過篩收集樹脂，濾液檢測：吸附濾液達托霉素400g，吸附率94.7%o[0051]B、樹脂解吸:收集的樹脂，用氯化鈉水溶液清洗，清洗后的樹脂裝入解吸柱中（柱體積1000L）。[0052]分別用10%pH6（磷酸調(diào)）乙醇溶液（含5%氯化鈉）1000L解吸、40%pH6（磷酸調(diào)）乙醇溶液（含5%氯化鈉）1800L解吸，流速控制在每小時1/5倍柱體積。[0053]C、樹脂進一步解吸：再用51%pH6（磷酸調(diào)）乙醇溶液解吸，流速控制在每小時1/5倍柱體積。收集解吸流分共1950L，約2倍柱體積，含達托霉素4752g，解吸收率66%。收集液用磷酸調(diào)pH至6。[0054]D、納濾濃縮至450Lo[0055]2）、富集得到的達托霉素粗提取：A、酸性柱層析上柱液配制：邊攪拌邊向450L濃縮液中加入磷酸，調(diào)pH2o[0056]上柱（柱體積300L）：將上述濃縮液上柱吸附，流速控制在每小時1/3倍柱體積。[0057]洗脫：采用階梯梯度洗脫的方式，洗脫劑pH用磷酸調(diào)2左右，依次用40%乙醇溶液900L、44%乙醇溶液1200L、46%乙醇溶液1200L、50%乙醇溶液洗脫樹脂PRP512柱，流速控制在每小時1/3倍柱體積。[0058]洗脫過程中HPLC檢測，收集效價大于200pg/ml的流分，收集的洗脫流分共1000L。納濾濃縮至150L，含達托霉素3218g，吸附率67.7%o[0059]B、中柱柱層析上柱液配制：在樹脂PRP512酸性層析濃縮液中邊攪拌邊向150L濃縮液中加入0.25mol/L的氫氧化鈉調(diào)pH中性，然后再邊攪拌邊向濃縮液中加入1%氯化鈉。[0060]上柱（柱子體積200L）：將上述150L濃縮液上柱吸附，流速控制在每小時1/3倍柱體積。[0061]洗脫：采用45%乙醇溶液450L（含1%氯化鈉）洗脫樹脂PRP512柱，流速4.2L/min。再用30%乙醇溶液洗脫樹脂PRP512柱，流速4.3L/min。洗脫過程中HPLC檢測洗脫流分，洗至洗脫流分中達托霉素效價低于200pg/ml后停止洗脫。收集的洗脫流分用甲酸調(diào)pH至中性。合并洗脫流分1300L，用納濾機進行濃縮，濃縮至62L,含達托霉素1995g，吸附率62.0%o[0062]3）、達托霉素的精制：A、中性柱層析上柱液配制：上述62L樹脂PRP512層析濃縮液邊攪拌邊加入1%氯化鈉，同時加入0.25mol/L的氫氧化鈉溶液，調(diào)濃縮液pH至中性。[0063]上柱（柱子體積24L）：濃縮液按柱體積分5輪上柱吸附，每輪流速控制在2.4L/min。[0064]洗脫：采用5%乙醇水溶液洗脫C18柱，流速控制在2.4L/min。洗脫劑用量為150L

左右。再更換成10%乙醇溶液，流速不變，洗脫劑用量為200L左右，停止洗脫。洗脫過程中采用HPLC法檢測來收集的洗脫流分，收集的流分用甲酸調(diào)pH至6.0左右。[0065]合并5輪中達托霉素歸一化含量大于等于92%的流分，共375L，用納濾機濃縮40L,含達托霉素1.2kg，作為后續(xù)C18酸分層析步驟的上柱液使用。該步收率為60.2%。[0066]B、酸性柱層析上柱液配制：上述C18中性邊攪拌邊加入甲酸，調(diào)pH至3.0。[0067]上柱（柱子體積24L）：濃縮液按柱體積分2輪上柱，每輪流速控制在2.4L/min。[0068]洗脫：采用無水乙醇和甲酸（濃度為0.1%）組成混合洗脫劑按下列線性梯度洗脫，洗脫流速為2.4L/min。[0069]洗脫梯度時間程序表見下表洗脫過程中，在洗脫劑用量達到約72L開始收集流分；在洗脫劑用量達到約192L時停止洗脫。[0070]采用HPLC法檢測收集的流分，合并2輪中達托霉素歸一化含量大于等于95%的160L流分作為純組分進入后續(xù)工序。[0071]4）、凍干：采用冷凍干燥機對上述濃縮液進行凍干，冷凍干燥至粉末后，在20°C，并在壓力為10Pa的條件下凍干2小時，得成品780g。[0072]最后成品的純度97.4%,收率65.0%。[0073]實施例5:1）、發(fā)酵液中達托霉素富集：A、發(fā)酵液中達托霉素的吸附：發(fā)酵液4500L含達托霉素8267g加入150kg氯化鈉和500L（11%）的HZ816樹脂攪拌2h,檢測：吸附濾液達托霉素的效價93pg/ml,濾液余量中達托霉素419g，吸附率94.9%o[0074]B、達托霉素的解吸：過篩收集樹脂，用氯化鈉水溶液清洗，清洗后的樹脂裝入解吸柱中（柱體積1000L）。[0075]解吸時，分別用12%pH7（鹽酸調(diào)）甲醇溶液（含1%乙酸銨）500L解吸、41%pH7（鹽酸調(diào)）甲醇溶液（含1%乙酸銨）1000L解吸。流速控制在每小時1/2倍柱體積。[0076]C、達托霉素進一步解吸：之后再用53%pH7（鹽酸調(diào)）甲醇溶液解吸，流速控制在每小時1/2倍柱體積。收集解吸液共2600L，約2倍柱體積，含達托霉素5016g，解吸收率63.9%。收集液用鹽酸調(diào)pH至6.5。[0077]D、納濾濃縮至500L。[0078]2）、富集得到的達托霉素粗提?。篈、酸性柱層析上柱液配制：邊攪拌邊向500L濃縮液中加入鹽酸，調(diào)pH4。[0079]上柱（柱體積300L）：將上述濃縮液上柱吸附，流速控制在每小時1倍柱體積。[0080]洗脫：采用階梯梯度洗脫的方式，洗脫劑pH用鹽酸調(diào)4左右，依次用42%乙醇溶液900L、45%乙醇溶液1200L、47%乙醇溶液1200L（開始收集）、55%乙醇溶液洗脫樹脂PRP512柱，流速控制在每小時1/3倍柱體積。[0081]洗脫過程中HPLC檢測，收集效價大于200pg/ml的流分，收集的洗脫流分共1500L。納濾濃縮至90L,含達托霉素3044g，吸附率60.6%o[0082]B、中柱柱層析

上柱液配制：在樹脂PRP512酸性層析濃縮液中邊攪拌邊向150L濃縮液中加入0.25mol/L的氫氧化鈉調(diào)pH中性，然后再加入5%氯化鈉。[0083]上柱（柱子體積200L）：將上述90L濃縮液上柱吸附，流速控制在每小時1倍柱體積。[0084]洗脫：采用40%乙醇溶液800L（含1%氯化鈉）洗脫樹脂PRP512柱，流速4.4L/min。再用30%乙醇溶液洗脫樹脂PRP512柱，流速5.3L/min。洗脫過程中HPLC檢測洗脫流分，洗至洗脫流分中達托霉素效價低于200Mg/ml后停止洗脫。收集的洗脫流分用乙酸調(diào)pH至中性。合并洗脫流分1400L，用納濾機進行濃縮，濃縮至71L，含達托霉素1825g，吸附率60.0%。[0085]3）、達托霉素的精制：A