n-連接糖基化位點(diǎn)突變感染性克隆的構(gòu)建及鑒定

n-連接糖基化位點(diǎn)突變感染性克隆的構(gòu)建及鑒定

馬蹄感染病毒（aav）和人免疫缺陷病毒（呼吸道感染，i-1）屬于抗感染病毒科。本試驗(yàn)對(duì)中國(guó)EIAV強(qiáng)毒遼寧株(L株)及弱毒株的序列(DLV株和FDD株)進(jìn)行了測(cè)定和分析,我國(guó)馬傳染性貧血病毒強(qiáng)、弱毒囊膜基因gp90之間差異很大,具有明顯的規(guī)律性。在病毒基因的V3到V5區(qū),變異規(guī)律尤為明顯,且與推定的N-連接糖基化的個(gè)數(shù)密切相關(guān)。經(jīng)序列分析與氨基酸比較發(fā)現(xiàn),在gp90基因V3到V5區(qū),強(qiáng)毒存在3個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn),對(duì)應(yīng)的位置是N-191位,N-236位,N-246位而弱毒的對(duì)應(yīng)區(qū)域不存在N-連接糖基化位點(diǎn)。為此我們將感染性克隆pLGFD3-8株進(jìn)行了糖化突變,構(gòu)建了含有3個(gè)N-連接糖基化突變的分子克隆,并獲得相應(yīng)的衍生病毒。其結(jié)果為進(jìn)一步研究N-連接糖基化在我國(guó)馬傳貧弱毒疫苗的致弱過程中的作用奠定了基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1主要試劑和儀器EIAV全基因克隆質(zhì)粒pLGFD3-8是基于低拷貝載體pLG338的基礎(chǔ)上構(gòu)建的EIAV驢胎皮膚細(xì)胞疫苗株全基因感染性克隆、驢胎皮膚細(xì)胞(FDD)、驢駘皮膚細(xì)胞弱毒(FDDV)、大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、馬傳染性貧血病毒陽性血清和陰性血清均由哈爾濱獸醫(yī)研究所慢病毒研究組提供。1.1.2主要試劑和儀器:FITC標(biāo)記兔抗馬IgG購自Solarbio公司;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(LipofectamineTM2000reagent)、鼠源反轉(zhuǎn)錄試劑盒(M-MLVReverseTranscriptase)購自Invitrogen公司;ReverseTranscriptaseAssayColorimetrickit購自Roche公司;前病毒DNA及病毒RNA提取試劑盒均購自Qiagen公司。低溫高速離心機(jī)(SIGMA,PK-15)、PTC-100TMProgrammableThermaControllerPCR儀(PTC-100TM,MJResearch.INC)、紫外分光光度儀(UltraspecR3000,PharmaciaBiotechINC)、透射電子顯微鏡(JEM-1200EX,上海)、CO2恒溫培養(yǎng)箱(WMZK-01,上海醫(yī)用儀表廠)。1.1.3引用1.2循環(huán)循環(huán),2s,6530s,6516s,7個(gè)循環(huán)利用PCR技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)突變,PCR反應(yīng)體系為50μl,反應(yīng)條件:95℃2min;95℃30s,55℃30s,75℃16min,18個(gè)循環(huán);75℃16min。PCR反應(yīng)結(jié)束后,加入DpnI(20U),37℃消化1h,將消化后產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,依據(jù)氨芐青霉素抗性初步判斷是否完成突變,將初步篩選的陽性克隆送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。1.3rlappcr檢測(cè)n-1333-t-n-33以1F、1R為引物,以pLGFD3-8為模板進(jìn)行PCR?；厥誔CR產(chǎn)物2486bp的片段。將其連入pMD18-T中得到克隆pMD18-Tenv。在pMD18-Tenv上利用overlapPCR進(jìn)行突變操作,以N-191-F、N-191-R為引物,獲得了克隆pMD18-T-N191;以pMD18-T-N191為模板,以N-236-F、N-236-R為引物進(jìn)行突變,獲得了克隆pMD18-T-N191N236;以pMD18-T-N191N236為模板,以N-246-F、N-246-R為引物進(jìn)行突變,獲得了克隆pMD18-T-N191N236N246。用NcoⅠ、NruⅠ雙酶切pMD18-T-N191N236N246,并與pLGFD3-8的NcoⅠ、NruⅠ雙酶切的大片段相連獲得了全基因克隆pLGN191N236N246。1.4顆粒轉(zhuǎn)移和病毒遺傳后代用QIAprepSpinMiniprepKit試劑盒,純化質(zhì)粒DNA至OD1.5反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cna細(xì)胞接毒后培養(yǎng)10~15d,收集培養(yǎng)上清140μL按照試劑盒說明書操作提取病毒RNA并用DNA酶消化去除質(zhì)粒污染。以2R為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。以其為模板用2F、2R為引物進(jìn)行PCR,其產(chǎn)物大小為1347bp。PCR反應(yīng)條件:95℃5min;95℃30s,49℃30s,72℃1min,30個(gè)循環(huán);72℃10min。取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。1.6馬血清學(xué)檢測(cè)大鼠fddv感染細(xì)胞的表達(dá)將FDD細(xì)胞傳至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,24h后,接種vpLGFD3-8、vpLGN191N236N246,設(shè)立正常的FDD細(xì)胞和FDDV感染細(xì)胞作對(duì)照;37℃培養(yǎng)10d后,吸棄培養(yǎng)液,無水乙醇固定10min;0.5%PBST洗滌3次,每次3min,分別加入EIAV感染馬陽性血清、馬陰性血清(1100稀釋),37℃孵育1h后,加入FITC標(biāo)記鼠抗馬IgG50μL(150稀釋),37℃孵育30min;用PBST洗3遍,熒光顯微鏡下觀察。1.7懸浮物溶液制備細(xì)胞培養(yǎng)上清4℃、8000×g離心10min;將上清轉(zhuǎn)移至新離心管,按每2mL懸浮物中加1mLPEG溶液比例加入PEG試劑,充分混合后于冰上孵育過夜;次日,混合樣品用ReverseTranscriptaseAssayColorimetrickit測(cè)定培養(yǎng)物中的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。1.8透射電鏡觀察細(xì)胞在FDD細(xì)胞上接毒后,37℃培養(yǎng)至細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE變化,即細(xì)胞皺縮,變圓,脫落,形態(tài)改變時(shí),收取細(xì)胞制備電鏡切片,用透射電鏡觀察其病毒顆粒。2結(jié)果和分析2.1黃鼠尾糖基化突變發(fā)生在p3-iv區(qū)2.2染色和感染的結(jié)果2.2.1轉(zhuǎn)染fdd細(xì)胞將獲得的全長(zhǎng)嵌合克隆pLGN191N236N246質(zhì)粒以4μg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染六孔板培養(yǎng)FDD細(xì)胞,設(shè)立陰性對(duì)照和陽性對(duì)照(pLGFD3-8)。經(jīng)過FDD細(xì)胞連續(xù)傳代后病變明顯,細(xì)胞變暗、圓縮或變成線狀,部分細(xì)胞脫落(圖1)。2.2.2plus129239轉(zhuǎn)染對(duì)轉(zhuǎn)染率的影響于轉(zhuǎn)染后不同盲傳細(xì)胞代次接種10~15d后取細(xì)胞上清進(jìn)行env基因的RT-PCR檢測(cè),結(jié)果顯示,在pLGN191N236N246轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞中第三代可檢測(cè)到特異性擴(kuò)增產(chǎn)物,其大小為1347bp,其它對(duì)照轉(zhuǎn)染組均未發(fā)現(xiàn)有擴(kuò)增現(xiàn)象。這些結(jié)果表明獲得了具有感染性的全長(zhǎng)質(zhì)粒,并通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染得到了相應(yīng)的衍生病毒(圖2)。2.2.3間接免疫熒光檢測(cè)衍生病毒感染FDD細(xì)胞10~15d后,進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè),結(jié)果感染的FDD細(xì)胞膜表面和細(xì)胞漿內(nèi)均顯示強(qiáng)烈綠色熒光信號(hào),而未感染FDD細(xì)胞則無熒光信號(hào)(圖3)。2.2.4rt酶活性檢測(cè)在FDD細(xì)胞上收集pLGN191N236N246第三代衍生病毒培養(yǎng)上清進(jìn)行RT酶活性檢測(cè),設(shè)立陰性對(duì)照和陽性對(duì)照(pLGFD3-8)。結(jié)果表明:在FDD細(xì)胞上所顯示的逆轉(zhuǎn)錄酶活性與其父本相似(表2)。2.3衍生病毒在豬胎皮膚細(xì)胞的電鏡觀察用質(zhì)粒pLGN191N236N246轉(zhuǎn)染獲得的衍上病毒接種FDD細(xì)胞,通過透射電鏡在細(xì)胞漿以及細(xì)胞間隙可觀察到有大量呈球形的病毒粒子,直徑約為90~120nm,具有錐形的核心,為典型的馬傳染性貧血病毒粒子(圖4),證實(shí)pLGN191N236N246衍生毒對(duì)驢胎皮膚細(xì)胞具有感染性,可以在驢胎皮膚細(xì)胞中很好增殖。3自身遺傳多樣性馬傳染性貧血病毒(equineinfectiousanemiavirus,EIAV)、人免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirusType1HIV-1)以及猴免疫缺陷病毒(SimianimmunodeficiencyvirusSIV)等慢病毒均能逃逸宿主的免疫監(jiān)控并呈持續(xù)性感染,其可能原因之一是病毒表面蛋白的高度糖基化結(jié)果近年來,尤其是1983年人類發(fā)現(xiàn)HIV-1以后,世界范圍內(nèi)廣泛開展了對(duì)EIAV分子生物學(xué)的研究并取得了很多成果,尤其是反向遺傳技術(shù)的發(fā)展為慢病毒的研究提供了新的思路和手段。到目前為止已經(jīng)構(gòu)建了多個(gè)EIAV感染性克隆用于病毒各基因功能及其與病程之間關(guān)系的研究表1為本實(shí)驗(yàn)所用到的引物。根據(jù)我國(guó)EIAV強(qiáng)、弱毒N-連接糖基化位點(diǎn)的差異,以EIAV弱毒感染性分子克隆pLGFD3-8為基礎(chǔ)進(jìn)行突變,最終獲得了全基因克隆pLGN191N236N246。突變前后核苷酸序列變化。其中N-191位糖基化的變異包含3個(gè)堿基的突變,這3個(gè)堿基