微生物遺傳育種基因重組和育種

微生物遺傳育種基因重組和育種第1頁

重組與突變不一樣點(diǎn)：

突變是指一個(gè)細(xì)胞同一個(gè)基因組中某一點(diǎn)或某一DNA片段發(fā)生變異；而重組是來自兩個(gè)細(xì)胞不一樣基因組間遺傳物質(zhì)交換結(jié)果，重組可在微生物細(xì)胞不發(fā)生突變情況下形成新基因型與表型。微生物遺傳育種基因重組和育種第2頁雜交（Hybridization）:是指不一樣基因型親本個(gè)體或細(xì)胞（指單細(xì)胞生物）交配而產(chǎn)生子代過程。重組是分子水平上概念，而雜交是細(xì)胞水平上概念。雜交中必定含有重組，但重組則不限于雜交這一個(gè)形式。微生物遺傳育種基因重組和育種第3頁第一節(jié)細(xì)菌、放線菌接合及育種一、細(xì)菌接合作用

接合（Conjugation）：指供體菌與受體菌完整細(xì)胞經(jīng)過直接接觸而傳遞大段DNA（包含質(zhì)粒）遺傳信息現(xiàn)象。微生物遺傳育種基因重組和育種第4頁（一）接合現(xiàn)象發(fā)覺1946年，J.Lederberg和E.L.Tatum未來自E.coliK12兩種營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型菌株混合培養(yǎng)，其遺傳標(biāo)識(shí)如圖。結(jié)果在單獨(dú)培養(yǎng)平板上無菌落，而在混合培養(yǎng)平板上長(zhǎng)出了原養(yǎng)型菌落。微生物遺傳育種基因重組和育種第5頁對(duì)接合現(xiàn)象解釋：（1）可能是細(xì)菌接合后發(fā)生基因重組結(jié)果；（2）細(xì)菌并沒有接合，而是交換了DNA（轉(zhuǎn)化）；（3）細(xì)菌細(xì)胞并沒有接合，而是經(jīng)過培養(yǎng)基交換了養(yǎng)料，即互養(yǎng)；（4）細(xì)菌細(xì)胞并沒有接合，而是親本細(xì)菌發(fā)生了回復(fù)突變結(jié)果；（5）雖經(jīng)接合而未發(fā)生基因重組，只是形成異核體或雜合二倍體。微生物遺傳育種基因重組和育種第6頁（二）接合作用證實(shí)1、轉(zhuǎn)化作用排除因?yàn)樵趫?bào)道接合試驗(yàn)結(jié)果之前轉(zhuǎn)化試驗(yàn)已經(jīng)是眾所周知，所以有些人懷疑該結(jié)果是由轉(zhuǎn)化所造成。1950年，B.D.Davis設(shè)計(jì)了U形管試驗(yàn)否定了這一推測(cè)（見右圖）微生物遺傳育種基因重組和育種第7頁2、互養(yǎng)排除營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型細(xì)菌經(jīng)過培養(yǎng)基交換養(yǎng)料而產(chǎn)生現(xiàn)象稱為互養(yǎng)。Lederberg和Tatum將培養(yǎng)過一個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型細(xì)菌培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌、過濾，然后加入到另一營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型菌培養(yǎng)物中。即使前一個(gè)菌在培養(yǎng)、滅菌、過濾之前曾發(fā)生過裂解，也不能是后一個(gè)菌產(chǎn)生原養(yǎng)型。微生物遺傳育種基因重組和育種第8頁3、回復(fù)突變排除若要發(fā)生兩種突變回復(fù)突變，其幾率為10－12，這是不可能。微生物遺傳育種基因重組和育種第9頁4、異核體和雜合二倍體排除A＋B—A—B＋A＋B—A—B＋A＋B＋異核體雜合二倍體單倍重組體異核體和雜合二倍體遺傳性狀不穩(wěn)定，在傳代過程中會(huì)發(fā)生性狀分離，但事實(shí)恰恰相反，原養(yǎng)型菌落基因型是穩(wěn)定，證實(shí)是單倍重組體。微生物遺傳育種基因重組和育種第10頁（三）接合機(jī)制1、接合作用中兩菌株性別存在Lederberg和Tatum認(rèn)為在兩個(gè)細(xì)菌親本細(xì)胞在接合過程中起同等作用—即E.coli性系統(tǒng)被認(rèn)為是同宗配合。1952年，W.Hayes利用Lederberg和Tatum所做雜交試驗(yàn)，對(duì)（A）Met－Bio－（Sms或Smr）×（B）Thr－Leu－B1－（Smr或Sms）進(jìn)行研究。結(jié)果表明，在雜交期間，兩品系所起作用是不一樣，是一個(gè)單向異宗配合過程，兩品系在取得同時(shí)發(fā)生了性別改變。其中，供體品系相當(dāng)于雄性，而受體品系相當(dāng)于雌性。微生物遺傳育種基因重組和育種第11頁2、F因子存在（1）E.coli一些種（如品系A(chǔ)）記為F＋，帶有一個(gè)性因子，或致育因子F（fertilityfactor），而另一個(gè)不育型品系記作F－，記不帶有性因子；（2）雜交F＋×

F－是可育，雜交F－×

F－是不育；（3）F因子能夠傳遞，從F＋到F－細(xì)菌，但必須經(jīng)過細(xì)胞接觸；（4）F因子能夠自發(fā)喪失，一旦喪失就不再恢復(fù)，除非經(jīng)過另一個(gè)F＋細(xì)胞在傳遞過來。F＋細(xì)胞經(jīng)低濃度吖啶橙處理后喪失F因子，也會(huì)偶然自發(fā)地或經(jīng)紫外線處理喪失。微生物遺傳育種基因重組和育種第12頁3、F因子及F＋細(xì)胞特征F＋是一個(gè)可遺傳性狀，能夠自我復(fù)制，類似于染色體基因，但不是染色體基因，其轉(zhuǎn)移頻率可高達(dá)70％以上。

F因子是獨(dú)立于染色體外小型環(huán)狀DNA分子，含有自體復(fù)制及轉(zhuǎn)移到其它細(xì)胞中去能力。大小約是細(xì)菌基因組DNA2％，分子量為6.3×106d、94.5kb。整個(gè)基因組編碼94個(gè)蛋白質(zhì)，其中1／3基因與接合作用相關(guān)。微生物遺傳育種基因重組和育種第13頁

F因子基因組有三個(gè)主要基因叢，分別負(fù)責(zé)插入、復(fù)制和轉(zhuǎn)移功效。A.轉(zhuǎn)移區(qū)（Transfer-region）：是一個(gè)操縱子，由22個(gè)基因組成，33kb，位于F因子結(jié)構(gòu)圖60～93kb之間。其中，traJ、A、L、E、N、B、W、V、C、U、F、H這些基因與性菌毛合成與裝配相關(guān)；traY、Z、M、I、G、D等基因產(chǎn)物與DNA轉(zhuǎn)移相關(guān)；traG和traN基因產(chǎn)物與細(xì)菌結(jié)合相關(guān)；traS和traT基因產(chǎn)物與表面排斥相關(guān)。微生物遺傳育種基因重組和育種第14頁B.復(fù)制區(qū)（replication-region）：位于F因子結(jié)構(gòu)圖譜40～49kb，包含一個(gè)特異復(fù)制蛋白基因frp（Freplicationproteins）、決定不相容性基因inc（incompatibility）和一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)oriV（vegetativeoriginofreplication）。C.插入?yún)^(qū)（insertionregion）：位于F因子結(jié)構(gòu)圖譜93～17.6kb，包含四個(gè)插入序列，IS3有直接重復(fù)兩個(gè)，另外兩個(gè)是IS2和，它們主要與F因子整合、切除、易位相關(guān)。γδ微生物遺傳育種基因重組和育種第15頁F因子主要表現(xiàn)型是細(xì)胞表面有性菌毛，即F＋細(xì)胞表面都有性菌毛。F性菌毛分布在大腸桿菌表面，數(shù)目與F因子相當(dāng)，長(zhǎng)度為1～20um。

性菌毛功效：A.是兩性細(xì)胞接合時(shí)轉(zhuǎn)移DNA通道，又叫性纖毛橋（sexpilibridge）；B.又是特異phage吸附部位。微生物遺傳育種基因重組和育種第16頁4、接合時(shí)DNA轉(zhuǎn)移機(jī)制接合時(shí)DNA轉(zhuǎn)移機(jī)制當(dāng)前不詳，但能夠確定是：在接合時(shí)，性菌毛存在是必需。微生物遺傳育種基因重組和育種第17頁（四）F因子三種存在形式1、F＋：F因子在細(xì)胞中以游離狀態(tài)存在。2、Hfr（highfrequencyofrecombination）:F因子在細(xì)胞中以整合狀態(tài)存在。Hfr與F＋異同：（1）F＋與Hfr均能與F－菌株雜交；（2）F＋與Hfr均能合成細(xì)胞表面從屬物—性菌毛；（3）Hfr菌株總是從F＋菌株中得到，而F＋卻從未在Hfr菌株中得到過；（4）Hfr經(jīng)吖啶橙處理后性質(zhì)不變，而F＋經(jīng)吖啶橙處理后失去F因子；（5）Hfr與F－雜交后，F(xiàn)－性質(zhì)普通不會(huì)變；而F＋與F－雜交后，F(xiàn)－變?yōu)镕＋。微生物遺傳育種基因重組和育種第18頁3、F′：攜帶有部分核染色體基因F′因子，含有F′因子菌株稱為F′菌株。微生物遺傳育種基因重組和育種第19頁（五）三種“雄性”菌株與F－接合后結(jié)果1、F＋

×F－2F＋由性菌毛將不一樣接合型細(xì)菌連在一起，而且在細(xì)胞間形成胞質(zhì)橋（也稱接合管）。在形成接合對(duì)以后，F(xiàn)＋菌F因子進(jìn)行DNA滾環(huán)復(fù)制。單鏈轉(zhuǎn)入F－菌，并合成新互補(bǔ)鏈。微生物遺傳育種基因重組和育種第20頁2、Hfr

×F－Hfr＋F－Hfr染色體雙鏈中一條鏈在F因子處發(fā)生斷裂，由環(huán)狀變?yōu)榫€狀，F(xiàn)因子則位于線狀單鏈DNA末端，整段線狀染色體（單鏈）也以5′－末端引導(dǎo)，等速地轉(zhuǎn)移至F－細(xì)胞。經(jīng)過接合而取得新性狀受體細(xì)胞稱為接合子。（conjugant）微生物遺傳育種基因重組和育種第21頁微生物遺傳育種基因重組和育種第22頁3、F′

×F－2F′Hfr菌株F因子反常切除所形成F因子有兩種類型：I型：包含了染色體一個(gè)區(qū)域和不完全F′因子。II型：帶有完整F因子DNA和位于F因子插入兩端染色體基因。微生物遺傳育種基因重組和育種第23頁微生物遺傳育種基因重組和育種第24頁F′菌共同特征（1）I型F′普通攜帶基因是Hfr上末端，這部分基因在Hfr×

F－時(shí)是低頻轉(zhuǎn)移，而在F′×

F－時(shí)卻是高頻轉(zhuǎn)移。（2）II型F′菌使原來轉(zhuǎn)移頻率差異懸殊兩部分基因含有相同頻率。（3）F′菌最大特點(diǎn)是能構(gòu)建穩(wěn)定部分二倍體。微生物遺傳育種基因重組和育種第25頁F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)：經(jīng)過F′因子轉(zhuǎn)移而使受體菌改變它遺傳性狀現(xiàn)象稱為F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)或或性因子轉(zhuǎn)導(dǎo)或簡(jiǎn)稱性導(dǎo)（Fduction或sexduction）擬表型菌：指表型上屬于F′而遺傳性上仍是F＋

菌，也就是說表面沒有性菌毛，因而喪失了表面排斥性。微生物遺傳育種基因重組和育種第26頁微生物遺傳育種基因重組和育種第27頁（六）中止雜交試驗(yàn)原理：

假如人為地中止正在基因轉(zhuǎn)移雜交對(duì)，然后測(cè)定受體菌里遺傳標(biāo)識(shí)重組頻率，就能知道基因連鎖情況。微生物遺傳育種基因重組和育種第28頁1957年，E.L.Wollman和F.Jocob設(shè)計(jì)了中止雜交試驗(yàn)。供體菌Hfr，受體菌F－thr－leu－lac－gal－azirtonrstrr，將大約10倍F－菌和Hfr對(duì)數(shù)期菌混合，輕輕振蕩培養(yǎng)，在不一樣時(shí)間間隔取樣，在組織攪拌器中猛烈振蕩后，將培養(yǎng)物經(jīng)適當(dāng)稀釋后，涂布在含鏈霉素且以葡萄糖作為碳源基本培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇。微生物遺傳育種基因重組和育種第29頁中止雜交試驗(yàn)微生物遺傳育種基因重組和育種第30頁中止雜交試驗(yàn)結(jié)果：基因是以ori、thr、leu、azi、ton、lac、gal次序連續(xù)轉(zhuǎn)移。在這個(gè)試驗(yàn)中，對(duì)Hfr菌條件是，str基因在整個(gè)待測(cè)次序后端，假如strs基因率先進(jìn)入受體，取得重組體將在第一次選擇性培養(yǎng)基上被str殺死。另外，thr、leu選擇性標(biāo)識(shí)應(yīng)位于前端，如位于后端則無法測(cè)序。微生物遺傳育種基因重組和育種第31頁二、放線菌接合作用（一）放線菌基因重組發(fā)覺1955年，Sermonti夫婦在天蘭色鏈霉菌（streptomycescoelicoler）ISS株中首次發(fā)覺經(jīng)過遺傳性交換而產(chǎn)生重組，接著，Hopwood也用S.coelicolerA3(2)發(fā)覺了一樣重組。微生物遺傳育種基因重組和育種第32頁（二）放線菌性別1、三種性別原始致育型（IF，initialfertility）：相當(dāng)于E.coliF＋正常致育型（NF，normalfertility）：相當(dāng)于E.coliHfr超致育型（UF，ultrafertility）：相當(dāng)于E.coliF－微生物遺傳育種基因重組和育種第33頁2、認(rèn)為IF相當(dāng)于E.coliF＋、UF相當(dāng)于E.coliF－理由（1）IF以0.3％頻率轉(zhuǎn)變?yōu)閁F，在經(jīng)uv處理IF群體中曾經(jīng)得到作為受體高度可育UF菌株，這種情況類似于從F＋菌株中得到F－菌株；（2）IF×UF雜交中，UF受體菌株全部轉(zhuǎn)變?yōu)镮F，而染色體基因重組頻率大約為10－4，二者相差萬倍。這種情況與F＋×

F－相同。微生物遺傳育種基因重組和育種第34頁3、認(rèn)為NF相當(dāng)于Hfr理由（1）IF和NF都產(chǎn)生對(duì)于UF菌株含有抑制作用次甲霉素，而UF菌株則不產(chǎn)生這一抗菌素；（2）IF×UF雜交子代全部都是IF，這種轉(zhuǎn)變和染色體基因轉(zhuǎn)移無關(guān)，不過NF×UF雜交則不一樣，UF轉(zhuǎn)變?yōu)镹F都伴伴隨染色體重組；（3）NF菌株來自IF或是IF雜交子代，與E.coli中一樣。微生物遺傳育種基因重組和育種第35頁（三）放線菌致育因子經(jīng)研究發(fā)覺在S.coelicoler中存在著一個(gè)稱為Scp1致育因子。Scp1和F因子一樣也是一個(gè)質(zhì)粒，含有轉(zhuǎn)移性，在本身轉(zhuǎn)移同時(shí)還能夠帶動(dòng)染色體進(jìn)行轉(zhuǎn)移。另外Scp1還帶有與產(chǎn)生次甲霉素相關(guān)基因，Scp1屬于附加體質(zhì)粒。微生物遺傳育種基因重組和育種第36頁（四）天蘭色鏈霉菌三種致育類型與大腸桿菌三種致育類型之間區(qū)分1、大腸桿菌中F－×

F－是不育，但在天蘭色鏈霉菌中UF

×

UF是可育，只是頻率較低，說明還有另外一個(gè)致育因子存在；2、大腸桿菌中F＋×

F＋或Hfr×Hfr雜交可育性很低，除非使其中一個(gè)成為

F－擬表型，但在天蘭色鏈霉菌中NF×NF和IF×IF雜交中一部分是高度可育；3、大腸桿菌中F＋×

F－子代都是F－而Hfr×

F－子代都是F－，但在天蘭色鏈霉菌中IF×UF子代是IF，NF×UF子代也是NF。微生物遺傳育種基因重組和育種第37頁三、采取接合技術(shù)育種Hfr細(xì)菌和F－細(xì)菌接觸帶來兩個(gè)細(xì)菌細(xì)胞接合和染色體從Hfr細(xì)菌向F－細(xì)菌轉(zhuǎn)移。所以，接合雜交是確定特定基因粗略位置有效方法，也是育種一個(gè)伎倆。普通采取液體接合培養(yǎng)法，在接合時(shí)注意通氣和選擇標(biāo)識(shí)。選擇性標(biāo)識(shí)能夠用抗性標(biāo)識(shí)，也能夠用營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型。微生物遺傳育種基因重組和育種第38頁第二節(jié)轉(zhuǎn)化與育種轉(zhuǎn)化（transformation）：受體細(xì)胞直接吸收來自供體細(xì)胞離體DNA片段，并經(jīng)過交換把它整合到自己基因組中，從而取得了供體細(xì)胞一些遺傳性狀現(xiàn)象。取得新性狀受體稱為轉(zhuǎn)化子（transformant）。＊轉(zhuǎn)化不是兩個(gè)細(xì)胞直接接觸，而是供體細(xì)胞離體DNA與受體細(xì)胞直接接觸而轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)。微生物遺傳育種基因重組和育種第39頁一、轉(zhuǎn)化過程轉(zhuǎn)化包含兩個(gè)基本過程（1）從供體菌中提取遺傳物質(zhì)DNA并轉(zhuǎn)移到受體中；（2）供體遺傳物質(zhì)在受體中作用。微生物遺傳育種基因重組和育種第40頁微生物遺傳育種基因重組和育種第41頁微生物遺傳育種基因重組和育種第42頁微生物遺傳育種基因重組和育種第43頁微生物遺傳育種基因重組和育種第44頁（一）轉(zhuǎn)化DNA特點(diǎn)1、轉(zhuǎn)化子數(shù)目與DNA濃度關(guān)系在一定條件下轉(zhuǎn)化子數(shù)目與轉(zhuǎn)化DNA濃度成正比。細(xì)菌生長(zhǎng)量每毫升中轉(zhuǎn)化子數(shù)1041051031021022040608010012010100培養(yǎng)時(shí)間每毫升中轉(zhuǎn)化子數(shù)10－310－210－1DNA轉(zhuǎn)化飽和濃度微生物遺傳育種基因重組和育種第45頁2、DNA片段大小與轉(zhuǎn)化子數(shù)目標(biāo)關(guān)系對(duì)于轉(zhuǎn)化作用來說，轉(zhuǎn)化DNA片段必須含有一定大小。普通認(rèn)為，轉(zhuǎn)化DNA片段大小沒有上限，不過在制備轉(zhuǎn)化子過程中，往往人工打斷供體DNA分子，取得片段約107dal（大約10個(gè)基因左右）。在受體細(xì)胞攝取DNA時(shí)，可能還會(huì)深入斷裂，所以僅僅有大約0.5％供體基因組能夠進(jìn)入受體細(xì)胞。能發(fā)生轉(zhuǎn)化作用核苷酸鏈最少不低于450bp。微生物遺傳育種基因重組和育種第46頁3、單雙鏈DNA與轉(zhuǎn)化活性關(guān)系單鏈DNA轉(zhuǎn)化活性低，而雙鏈DNA轉(zhuǎn)化活性高。因而，DNA完整雙鏈結(jié)構(gòu)對(duì)于轉(zhuǎn)化活性來說是必要。微生物遺傳育種基因重組和育種第47頁4、轉(zhuǎn)化DNA命運(yùn)大量試驗(yàn)證實(shí)，在轉(zhuǎn)化作用中遺傳重組是由供體單鏈序列取代了受體DNA單鏈序列，使受體DNA標(biāo)識(shí)變成了供體遺傳標(biāo)識(shí)，并恒定表示，遺傳給它后代。微生物遺傳育種基因重組和育種第48頁（二）受體細(xì)胞特點(diǎn)1、受體細(xì)胞感受態(tài)（1）概念

只有在某一特定條件下培養(yǎng)部分細(xì)胞才有吸收DNA能力，這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞。這種感受態(tài)細(xì)胞所處狀態(tài)稱為感受態(tài)（competence）。微生物遺傳育種基因重組和育種第49頁（2）感受態(tài)特點(diǎn)和影響原因特點(diǎn)：感受態(tài)不是一個(gè)透性特征，而是在適當(dāng)生長(zhǎng)條件下取得一個(gè)生理特征影響原因：受菌齡影響：普通認(rèn)為感受態(tài)出現(xiàn)在細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期后期；受遺傳原因影響；受環(huán)境條件影響。微生物遺傳育種基因重組和育種第50頁2、感受態(tài)百分比不一樣細(xì)菌感受態(tài)百分比是不一樣，普通為10％～20％。3、感受態(tài)可在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移微生物遺傳育種基因重組和育種第51頁4、感受態(tài)因子（CF）1963年，R.Pakula和W.Walczak首次從鏈球菌中分離得到；1972年，Leonard和Cale純化一個(gè)蛋白質(zhì)，稱為CF。該蛋白質(zhì)在感受態(tài)轉(zhuǎn)移中起作用。在感受態(tài)細(xì)胞表面存在著一個(gè)特定抗原，而非感受態(tài)細(xì)胞則沒有這種抗原。細(xì)菌細(xì)胞在特定時(shí)期產(chǎn)生一個(gè)感受態(tài)因子（CF），CF與膜上受體結(jié)合，刺激核內(nèi)DNA產(chǎn)生另一個(gè)蛋白——自溶素（Autolysin），自溶素轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間周質(zhì)內(nèi)作用于細(xì)胞膜，并改變膜成份，使細(xì)胞膜便于DNA吸收。微生物遺傳育種基因重組和育種第52頁二、轉(zhuǎn)化過程基因重組及育種（一）轉(zhuǎn)化技術(shù)用于基因定位在轉(zhuǎn)化過程中，兩個(gè)連鎖基因能夠同時(shí)轉(zhuǎn)化，但能夠同時(shí)轉(zhuǎn)化基因卻不一定是連鎖，因?yàn)榘@兩個(gè)基因DNA片段能夠同時(shí)被受體細(xì)菌所吸收。微生物遺傳育種基因重組和育種第53頁假如a+和b+是連鎖，那么當(dāng)DNA濃度下降時(shí)，a+b+轉(zhuǎn)化頻率下降與a+或b+轉(zhuǎn)化頻率下降相同；相反，假如a+和b+并不連鎖，那么a+b+轉(zhuǎn)化頻率下降將遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出a+或b+轉(zhuǎn)化頻率。這是因?yàn)樵贒NA低濃度范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生與DNA濃度成正比。當(dāng)a+、

b+兩個(gè)基因位于同一DNA片段上是，a+b+轉(zhuǎn)化子與DNA濃度成正比增加；當(dāng)a+b+基因分別位于不一樣DNA片段上是，在一定DNA濃度內(nèi)，a+b+轉(zhuǎn)化子與DNA濃度平方成正比。經(jīng)過這么試驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)化基因連鎖情況能夠方便繪制出遺傳圖譜。微生物遺傳育種基因重組和育種第54頁以trp+和tyr+DNA作為供體q＝trp+tyr—＋trp—tyr+trp+tyr—trp+tyr+trp—tyr+＋＋微生物遺傳育種基因重組和育種第55頁共轉(zhuǎn)指數(shù)：如將DNA加入到受體菌中，會(huì)產(chǎn)生、和三種轉(zhuǎn)化子，將型轉(zhuǎn)化子在其中所占百分比稱為共轉(zhuǎn)指數(shù)（cotransferindex）共轉(zhuǎn)指數(shù)＝a+b+＋＋a+b+a－b+a+b－微生物遺傳育種基因重組和育種第56頁（二）轉(zhuǎn)化育種利用在轉(zhuǎn)化過程中供體菌可將遺傳性狀傳遞給受體菌這種特征，育種工作者能夠采取轉(zhuǎn)化方法到達(dá)育種目標(biāo)。微生物遺傳育種基因重組和育種第57頁第三節(jié)轉(zhuǎn)導(dǎo)與育種一、轉(zhuǎn)導(dǎo)概念經(jīng)過完全缺點(diǎn)或部分缺點(diǎn)噬菌體為媒介，把供體細(xì)胞DNA片段攜帶到受體細(xì)胞中，經(jīng)過交換和整合，從而使后者取得前者部分遺傳性狀現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）。取得新性狀受體細(xì)胞就稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子（transductant）。轉(zhuǎn)導(dǎo)有兩種類型，即普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限轉(zhuǎn)導(dǎo)。微生物遺傳育種基因重組和育種第58頁二、轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象發(fā)覺及證實(shí)1952年，N.Zinder和Lederberg在研究鼠傷寒沙門氏菌遺傳重組時(shí)，采取兩種營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型菌：LA2:phe+trp+met－h(huán)is－LA22:phe－trp－met+his+在將二者混合培養(yǎng)后取得了原養(yǎng)型。同時(shí)，再將二者放入Davis管中培養(yǎng)時(shí)仍出現(xiàn)重組體，這就證實(shí)在兩株菌之間有一個(gè)過濾性因子起作用。微生物遺傳育種基因重組和育種第59頁過濾性因子是噬菌體（phage）證實(shí)：過濾性因子不會(huì)因DNase處理而失去活性，說明它不是裸露在溶液中DNA，故能夠排除轉(zhuǎn)化作用，另外因?yàn)閮蓚€(gè)菌是隔離培養(yǎng)因而也能夠排除接合作用；過濾性因子與從溶源性菌分離到噬菌體P22含有相同大小質(zhì)量；用抗P22血清或加熱處理，使P22感染性和過濾性因子功效失活速率相同；抗P22沙門氏菌菌株同時(shí)也對(duì)過濾性因子表現(xiàn)為抗性。所以能夠證實(shí)：過濾性因子就是溫和型噬菌體P22。微生物遺傳育種基因重組和育種第60頁三、普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalizedtransduction）

經(jīng)過完全缺點(diǎn)phage對(duì)供體菌任何DNA小片段“誤包”，而實(shí)現(xiàn)其遺傳性狀傳遞至受體菌轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象，稱為普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)。微生物遺傳育種基因重組和育種第61頁微生物遺傳育種基因重組和育種第62頁微生物遺傳育種基因重組和育種第63頁（一）完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體在進(jìn)行包裝時(shí)，有極少數(shù)phage（10－6～10－8）衣殼將與頭部DNA相仿一小段供體DNA片段誤包在內(nèi)，形成完全不含phage本身DNA假噬菌體，這種假噬菌體稱為完全缺點(diǎn)噬菌體。由完全缺點(diǎn)噬菌體介導(dǎo)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)稱為完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)。微生物遺傳育種基因重組和育種第64頁（二）流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)簡(jiǎn)稱流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)（abortivetransduction）。經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)而取得了供體菌DNA片段受體菌，假如其外源DNA在體內(nèi)既不進(jìn)行交換、整合、復(fù)制，也不快速消失，而進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯及性狀表示，這種現(xiàn)象稱為流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體菌能夠在選擇性培養(yǎng)基上形成微小菌落。微生物遺傳育種基因重組和育種第65頁四、不足轉(zhuǎn)導(dǎo)（specializedtransduction）指經(jīng)過部分缺點(diǎn)溫和噬菌體把供體菌少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并取得表示轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。特點(diǎn)：1、只能是個(gè)別特定基因；2、該特定基因由部分缺點(diǎn)噬菌體攜帶；3、缺點(diǎn)噬菌體是因?yàn)樵谄湫纬蛇^程中所發(fā)生低頻率“誤切”或因?yàn)殡p重溶源菌裂解而形成。

微生物遺傳育種基因重組和育種第66頁微生物遺傳育種基因重組和育種第67頁局限轉(zhuǎn)導(dǎo)微生物遺傳育種基因重組和育種第68頁微生物遺傳育種基因重組和育種第69頁（一）低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（LFT，lowfrequencytransduction）因?yàn)樗拗魅旧w上進(jìn)行不正常切離頻率極低，所以在裂解物中所含部分缺點(diǎn)phage百分比也極低。這種裂解物稱為L(zhǎng)FT裂解物。LFT裂解物在低m.o.i.情況下感染宿主，可取得極少許局限轉(zhuǎn)導(dǎo)，這就是低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)。m.o.i.：稱作感染復(fù)數(shù)，是指每一個(gè)敏感細(xì)胞所能吸附對(duì)應(yīng)phage數(shù)量。微生物遺傳育種基因重組和育種第70頁（二）高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（HFT，highfrequencytransduction）雙重溶源菌：在高m.o.i.情況下，受體菌會(huì)同時(shí)吸附缺點(diǎn)型phage和完整phage，而且能夠同時(shí)整合在受體菌核染色體組上，這時(shí)受體菌稱為雙重溶源菌。此時(shí)，正常phage稱為助體phage。由雙重溶源菌形成裂解物稱為HFT裂解物。高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)：用低m.o.i.HFT裂解物去感染受體細(xì)胞，則可高頻率發(fā)生局限轉(zhuǎn)導(dǎo)，這就是高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)。微生物遺傳育種基因重組和育種第71頁五、轉(zhuǎn)導(dǎo)用于基因定位普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體通常能夠用于繪制供體菌遺傳圖譜。應(yīng)用于基因定位共轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象：

P1噬菌體基因組約為染色體長(zhǎng)度2.4％，P1噬菌體感染E.coli后能夠隨意包裹寄主DNA片段，只要這個(gè)片段包含基因座位不超出E.coli遺傳圖譜兩分鐘距離，均可一起被轉(zhuǎn)導(dǎo)，這是普通用接合和轉(zhuǎn)化作用來進(jìn)行基因定位所難以實(shí)現(xiàn)，對(duì)細(xì)菌染色體小片段精細(xì)結(jié)構(gòu)十分有用。兩個(gè)鄰近基因一起被轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象稱為共轉(zhuǎn)導(dǎo)（co－transduction)。微生物遺傳育種基因重組和育種第72頁當(dāng)轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA片段進(jìn)入受體后，與受體同源分子進(jìn)行重組，當(dāng)另一個(gè)基因標(biāo)識(shí)被選擇時(shí)，那么另一個(gè)鄰近基因發(fā)覺頻率伴隨它們二者之間距離降低而增大，這個(gè)頻率稱為共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率（cotransductionfrequency）。用下式表示：

F＝（1－d／L）3

d為兩個(gè)基因之間距離，L是P1基因組或轉(zhuǎn)導(dǎo)片段長(zhǎng)度（在遺傳圖譜上用分鐘表示）。比如：有兩個(gè)基因共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率是65％，L為2分鐘（約76kb）。這兩個(gè)基因之間距離為0.26分鐘（約10kb）。微生物遺傳育種基因重組和育種第73頁六、轉(zhuǎn)導(dǎo)育種利用轉(zhuǎn)導(dǎo)法選育目標(biāo)菌，首要任務(wù)是要取得轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體。轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體取得：噬菌體侵染供體菌后，在感染末期，少數(shù)噬菌體會(huì)將供體菌DNA誤認(rèn)為是它們自己DNA，并以其外殼蛋白將細(xì)菌DNA包圍起來，從而形成轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體。因?yàn)榧?xì)菌DNA任何部分都能夠被包裝，所以，要取得目標(biāo)轉(zhuǎn)導(dǎo)子必須要經(jīng)過那些選擇性標(biāo)識(shí)。微生物遺傳育種基因重組和育種第74頁轉(zhuǎn)導(dǎo)育種過程操作過程以下：

先將供體菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)久，然后向其中加入噬菌體，繼續(xù)培養(yǎng)是一部分供體菌發(fā)生裂解反應(yīng)而釋放出轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體。加入氯仿以殺死仍活著供體菌，待完全溶菌后低速離心以除去菌體殘?jiān)?，上清液?jīng)Dnase處理和微孔濾膜除菌后，即制成供體菌裂解液。將受體菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)久，向其中加入供體菌裂解液，待轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體吸附后，低速離心搜集菌體。將該菌體轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)即可從中取得目標(biāo)轉(zhuǎn)導(dǎo)子。首先要進(jìn)行噬菌體效價(jià)測(cè)定。所謂噬菌體效價(jià)就是1ml培養(yǎng)液中含有活噬菌體數(shù)目。微生物遺傳育種基因重組和育種第75頁第四節(jié)微生物原生質(zhì)體融合和育種一、原生質(zhì)體融合概念所謂原生質(zhì)體融合，就是將雙親株微生物細(xì)胞分別經(jīng)過酶解脫壁，使之成為原生質(zhì)體。然后在高滲條件下混合，并加入物理、化學(xué)、生物助融條件，使雙親株原生質(zhì)體間發(fā)生相互凝集。經(jīng)過細(xì)胞質(zhì)融合、核融合，而后發(fā)生基因組間交換、重組，進(jìn)而能夠在適宜條件下再生出微生物細(xì)胞壁來，從而取得重組子過程。微生物遺傳育種基因重組和育種第76頁狹義原生質(zhì)體（protoplast）即細(xì)胞壁被徹底酶解完全脫壁后形成1、原生質(zhì)體

廣義原生質(zhì)體既包含狹義原生質(zhì)體也包含不完全脫壁后形成圓球體（spheroplast）

物理：瞬時(shí)高壓交變電場(chǎng)或激光等2、助融條件化學(xué)：聚乙二醇、二甲亞砜、伴刀豆球蛋白A、磷脂酰絲氨酸、溶血卵磷脂等

生物：仙臺(tái)病毒、雞新城疫病毒、等關(guān)于原生質(zhì)體概念解釋：微生物遺傳育種基因重組和育種第77頁二、原生質(zhì)體融合在生物工程中地位生物工程（biotechnology）細(xì)胞工程基因工程酶工程發(fā)酵工程固定化細(xì)胞基因體外重組染色體移植或引入細(xì)胞器移植核移植固定化酶酶分子改造和修飾發(fā)酵自動(dòng)化產(chǎn)品后處理泛指遺傳工程組織培養(yǎng)原生質(zhì)體融合微生物遺傳育種基因重組和育種第78頁1、原生質(zhì)體融合是一個(gè)更為廣泛，更為隨機(jī)基因重組方式；2、原生質(zhì)體融合方式，能夠打破微生物種屬界限，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣菌株間基因重組；3、原生質(zhì)體融合能夠使遺傳物質(zhì)傳遞更為完全，能夠取得更多基因重組機(jī)會(huì)，有利于提升育種速度；4、借助融合劑可同時(shí)將幾個(gè)親本原生質(zhì)體隨即融合在一起，從而取得綜合幾個(gè)親本性狀重組體，加速育種進(jìn)程；5、原生質(zhì)體融合能夠和其它育種方法相結(jié)合，把從其它方法得到優(yōu)良性狀經(jīng)過原生質(zhì)體融合在組合到一個(gè)單株中，提升菌株產(chǎn)量幾率增大；三、原生質(zhì)體融合及原生質(zhì)體技術(shù)理論與實(shí)踐意義微生物遺傳育種基因重組和育種第79頁6、原生質(zhì)體融合能夠大大提升遺傳重組頻率；7、在生產(chǎn)菌種選育中，能夠應(yīng)用含有較高產(chǎn)量性狀菌株作為融合時(shí)出發(fā)菌株，以期到達(dá)理想育種目標(biāo)；8、能夠應(yīng)用滅活原生質(zhì)體進(jìn)行融合，從而提升篩選效率，省去育種過程中對(duì)親株遺傳標(biāo)識(shí)，省去人力、物力和時(shí)間，也可預(yù)防因增加標(biāo)識(shí)而降低出發(fā)菌株產(chǎn)量；9、原生質(zhì)體技術(shù)有利于建立工業(yè)微生物轉(zhuǎn)化體系，開辟新育種路徑；10、對(duì)微生物制備原生質(zhì)體后直接再生育種、原生質(zhì)體誘變后再生育種、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化育種、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)導(dǎo)育種、原生質(zhì)體固定化等原生質(zhì)體技術(shù)在微生物育種與工業(yè)生產(chǎn)中近年來已日趨廣泛開展；11、在理論上，微生物原生質(zhì)體融合可用于研究噬菌體與寄主間關(guān)系，深入了解溶源機(jī)理及免疫因子和存在部位；研究原噬菌體DNA在寄主染色體上結(jié)合位點(diǎn)；微生物遺傳育種基因重組和育種第80頁12、在細(xì)胞學(xué)研究方面，經(jīng)過原生質(zhì)體融合，有利于研究核質(zhì)關(guān)系及細(xì)胞質(zhì)遺傳問題；13、微生物原生質(zhì)體融合，可用于遺傳性分析等理論研究。微生物遺傳育種基因重組和育種第81頁

（1）標(biāo)識(shí)菌株篩選；（2）原生質(zhì)體制備；（3）原生質(zhì)體再生；（4）原生質(zhì)體融合；（5）融合子選擇；（6）實(shí)用型菌株篩選。四、原生質(zhì)體融合育種基本程序原生質(zhì)體融合普通包含以下步驟：微生物遺傳育種基因重組和育種第82頁BAABa+b-a-b+菌株標(biāo)識(shí)細(xì)胞壁溶菌酶AB細(xì)胞膜加PEG混合融合原生質(zhì)體轉(zhuǎn)再生平皿2BA134篩選融合子溫浴穩(wěn)定高產(chǎn)重組子標(biāo)識(shí)營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞原生質(zhì)體1－a+b-2－a+b+3－a-b-4－a-b+原生質(zhì)體形成融合CW再生穩(wěn)定正變株篩選細(xì)胞原生質(zhì)體融合程序示意圖微生物遺傳育種基因重組和育種第83頁（一）標(biāo)識(shí)菌株篩選在原生質(zhì)體融合過程中，為了便于篩選，通常對(duì)于所用親株都要進(jìn)行一定遺傳標(biāo)識(shí)。

普通能夠采取營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)標(biāo)識(shí)和抗藥性標(biāo)識(shí)。微生物遺傳育種基因重組和育種第84頁（二）原生質(zhì)體制備

在細(xì)菌和放線菌中主要采取溶菌酶；

在酵母菌和霉菌中普通可用蝸牛酶和纖維素酶。微生物遺傳育種基因重組和育種第85頁影響原生質(zhì)體制備原因1、菌體預(yù)處理為了使酶作用效果更加好一些，可對(duì)菌體進(jìn)行預(yù)處理，包含菌體培養(yǎng)階段預(yù)處理和酶解前預(yù)處理。對(duì)于細(xì)菌可加入甘氨酸、青霉素和D－環(huán)絲氨酸等，對(duì)于放線菌能夠使用甘氨酸（1－4％）等，在酵母菌中加入EDTA和巰基乙醇等。

微生物遺傳育種基因重組和育種第86頁2、菌體培養(yǎng)時(shí)間

為了使菌體易于原生質(zhì)體化，普通選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)久菌體。普通對(duì)于細(xì)菌采取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)久后期為好，對(duì)于放線菌采取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)久與穩(wěn)定時(shí)之間轉(zhuǎn)換期最為適當(dāng)。微生物遺傳育種基因重組和育種第87頁3、酶濃度普通來講，酶濃度增加，原生質(zhì)體形成率增加，不過超出一定范圍，則原生質(zhì)體形成率增加效果不顯著；酶濃度過低，則造成原生質(zhì)體再生率下降。通常，采取當(dāng)原生質(zhì)體形成率和再生率之積到達(dá)最大時(shí)酶濃度作為最正確酶濃度。微生物遺傳育種基因重組和育種第88頁4、酶解溫度

溫度對(duì)酶解作用有雙重影響。首先，伴隨溫度提升，酶解反應(yīng)速度加緊；另首先，伴隨溫度增加，酶蛋白逐步變性而失活。所以，最適溫度是這兩方面共同結(jié)果。普通在選擇最正確溫度時(shí)，除了考慮酶最適溫度外，還要以原生質(zhì)體再生率加以校正。微生物遺傳育種基因重組和育種第89頁5、酶解時(shí)間原生質(zhì)體制備質(zhì)量與酶解時(shí)間有親密關(guān)系。酶解時(shí)間過短，原生質(zhì)體形成不完全，結(jié)果會(huì)影響到融合；酶解時(shí)間過長(zhǎng)，原生質(zhì)體脫壁太完全，原生質(zhì)體質(zhì)膜也會(huì)受到損傷，從而會(huì)影響到再生，最終也不利于融合。所以，選擇一個(gè)最適酶解時(shí)間對(duì)于原生質(zhì)體融合是非常主要。微生物遺傳育種基因重組和育種第90頁6、原生質(zhì)體制備液（滲透壓穩(wěn)定劑）

高滲透壓在原生質(zhì)體制備中不但起到保護(hù)原生質(zhì)體免于膨脹作用，而且有利于酶與底物結(jié)合。滲透壓穩(wěn)定劑選擇：細(xì)菌－蔗糖、丁二酸鈉、NaCl等酵母菌－山梨醇、甘露醇等霉菌－KCL、NaCl等

滲透壓穩(wěn)定劑濃度普通采取0.3～0.8％mol/L。微生物遺傳育種基因重組和育種第91頁原生質(zhì)體形成率＝破壁前菌數(shù)－剩下菌數(shù)破壁前菌數(shù)×100％原生質(zhì)體形成率計(jì)算微生物遺傳育種基因重組和育種第92頁（三）原生質(zhì)體再生

普通在進(jìn)行原生質(zhì)體再生時(shí)，采取含有滲透壓穩(wěn)定劑培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。滲透壓穩(wěn)定劑選擇同制備時(shí)是一樣。原生質(zhì)體再生是一個(gè)復(fù)雜過程，其影響原因有很多，包含菌體本身再生特征、原生質(zhì)體制備條件、再生培養(yǎng)基成份、再生培養(yǎng)條件等等。微生物遺傳育種基因重組和育種第