乙肝病毒核酸檢測實驗操作流程

乙肝病毒核酸檢測

試驗操作流程廣西臨床檢查中心唐娟第1頁主要內(nèi)容HBV-DNA檢測原理HBV-DNA操作流程

HBV-DNA檢測成果分析臨床意義DNA提取PCR

擴增標本采集第2頁檢測原理第3頁HBV：用一對乙型肝炎病毒特性引物（Primer）和一條乙型肝炎病毒特異性熒光探針，配以PCR反應液、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、四種脫氧核苷酸單體（dNTPs）等成份，用PCR體外擴增法定量檢測乙型肝炎病毒DNA第4頁原理圖每產(chǎn)生一條DNA鏈，就切斷一條探針每切斷一條探針，就產(chǎn)生一種熒光信號信號強度與結(jié)合探針DNA分子數(shù)成正比第5頁操作流程第6頁一、標本采集一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2毫升，注入無菌干燥玻璃管室溫（22～25oC）放置30～60分鐘血標本使用水平離心機，4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘吸取上層血清，轉(zhuǎn)移至1.5ml滅菌離心管

血清采集血漿采集用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2毫升，注入含EDTA或枸櫞酸鈉抗凝劑試管立即輕輕顛倒玻璃管混合5～10次，使抗凝劑與靜脈血充足混勻5～10分鐘后即可分離出血漿，轉(zhuǎn)移至1.5ml滅菌離心管第7頁注意事項盡可能吸取血清上層液，有纖維蛋白標本應離心清除脂類渾濁標本拒收（離心4000rpm，5min）血清血清不能使用肝素抗凝由于對PCR擴增有抑制作用，且很難在核酸提取過程中完全清除血漿第8頁二.HBV-DNA提取打開HBV-DNA試劑盒↓↓取出DNA濃縮液、DNA提取液（置室溫融解，充足混勻）↓↓取已滅菌1.5ml離心管并按樣本唯一編號↓↓加入DNA濃縮液和待測樣本各100ul（振蕩混勻）↓↓12023rpm，離心10min↓↓去上清，沉淀中加入20ulDNA提取液（振蕩混勻）

（陰、陽性質(zhì)控品處理辦法：各取50ul，分別加入DNA提取液各50ul）↓↓100℃恒溫干浴10min↓↓12023rpm離心5min第9頁注意事項1.加入等體積濃縮液后請用震蕩器劇烈震蕩混勻。不能用移液器混勻2.標本12023rpm離心時一定要統(tǒng)一離心管擺放方向。離心后應沿著沉淀存在對側(cè)緩緩吸去上清，槍頭貼管壁順著液面下移，避免帶走不可見沉淀物。如沉淀不顯著能夠保存少許液體，提議將移液器量程調(diào)至190ul一次性吸取。第10頁注意事項3.濃縮離心后若出現(xiàn)有“絮狀懸浮物”，去上清時應一并把“絮狀懸浮物”吸除，不影響試驗成果。如不吸取絮狀懸浮物會造成試驗成果偏低。4.加入20ulDNA提取液（DNA提取液用前充足融解混勻),并用震蕩器劇烈震蕩混勻20秒后,瞬時離心。5.裂解溫度要確保有100℃±1，裂解時間10min±1第11頁三.PCR擴增步驟取上清液2ul點樣↓↓8000rpm離心數(shù)秒↓↓按次序放進擴增儀微孔中↓↓編輯軟件，設置循環(huán)條件↓↓保存文獻，運行

注意：吸取上清液中上層2ul進行加樣，不要吸取到沉淀。第12頁循環(huán)條件循環(huán)次數(shù)、溫度93℃2分鐘93℃45秒→55℃60秒→10個循環(huán)93℃30秒→55℃45秒→30個循環(huán)第13頁成果分析第14頁1.第15頁2.成果讀取第16頁3.成果報告成果報告必須簡單清楚定量測定則必須報告量多少

1、成果高于測定辦法線性范圍上限，可報告>多少；也可對樣本稀釋后再測，成果乘以稀釋倍數(shù)

2、成果低于辦法測定范圍下限，則報告多少即可，不能報告“0”或陰性第17頁臨床意義1、診斷早期乙型肝炎，提升HBV檢測陽性率。2、判斷HBV傳染性及病毒復制情況，綜合血清學指標，為臨床提供