質(zhì)粒DNA的提取、定量、酶切與PCR鑒定實驗報告

質(zhì)粒DNA的提取、定量、酶切與PCR鑒定一、實驗?zāi)康?.學(xué)習(xí)并掌握用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的方法；2.學(xué)習(xí)并掌握了解質(zhì)粒酶切鑒定的方法；3.學(xué)習(xí)并掌握紫外吸收檢測DNA濃度和純度的原理和方法；4.學(xué)習(xí)并掌握PCR基因擴增的實驗原理和操作方法；5.學(xué)習(xí)并掌握水平式瓊脂糖凝膠電泳的原理和使用方法。二、實驗原理1.PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))在DNA聚合酶催化下，可以DNA為模板，以特定引物為延伸起點，以dNTP為原料，通過變性、退火、延伸等步驟，在體外（緩沖液中）復(fù)制DNA，使目的DNA按2n方式呈指數(shù)形式擴增。PCR一次循環(huán)的具體反應(yīng)步驟為：A.變性：加熱反應(yīng)系統(tǒng)至95℃，使模板DNA在高溫下完全變性，雙鏈解鏈。B.退火：逐漸降低溶液溫度，使合成引物在低溫（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），與模板DNA互補退火形成部分雙鏈。C.延伸：溶液反應(yīng)溫度升至中溫72℃，在Taq酶作用下，以dNTP為原料，引物為復(fù)制起點，模板DNA的一條單鏈在解鏈和退火之后延伸為一條雙鏈。2.質(zhì)粒DNA的提取與制備(1).堿裂解法：染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性存在差異：A.高堿性條件下，染色體DNA和質(zhì)粒DNA均變性；B.當(dāng)以高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH值至中性時，變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性并保存在溶液中，染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可通過離心形成沉沉淀去除。(2).離心層析柱：A.硅基質(zhì)膜在高鹽、低pH值狀態(tài)下可選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白質(zhì)和多糖等物質(zhì)；B.通過去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除；

C.低鹽，高pH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。質(zhì)粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A.物質(zhì)在光的照射下會產(chǎn)生對光的吸收效應(yīng)，且其對光的吸收是具有選擇性；B.各種不同的物質(zhì)都具有其各自的吸收光譜:DNA分對波長260nm的紫外光有特異的吸收峰蛋白質(zhì)對波長280nm的紫外光有特異的吸收峰碳水化合物對230nm的紫外光有特異的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反應(yīng)DNA的純度；A260/A280=1.8DNA純凈A260/A280<1.8表示樣品中含蛋白質(zhì)（芳香族）或酚類物質(zhì)A260/A280>1.8含RNA雜質(zhì)，用RNA酶去除。質(zhì)粒DNA的酶切鑒定：限制性內(nèi)切酶是DNA重組操作過程中所使用的基本工具。限制性內(nèi)切酶能特異性地與一段被稱為限制酶識別序列的特殊DNA序列結(jié)合，或是與其附近的特異位點結(jié)合，并在結(jié)合位點切割雙鏈DNA。加入加入250μl溶液S1，吹打，使細(xì)菌沉淀分散，徹底懸浮加入250加入250μl溶液S2，顛倒4～6次混勻（不要劇烈振蕩），直到溶液變得清亮加入加入350μl溶液S3，立即溫和混勻6~8次。13000rpm離心10min，小心取上清液（500-800μl）將吸附柱放于收集管中，將上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm將吸附柱放于收集管中，將上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm離心3min，棄濾液加入500加入500μl去蛋白液(W1)，13000rpm離心1min，棄濾液向吸附柱中加入向吸附柱中加入700μl漂洗液W2，13000rpm離心1min，棄濾液；重復(fù)一遍操作空柱空柱13000rpm離心1min，然后室溫放置3min，使殘留乙醇揮發(fā)取出吸附柱，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間加50取出吸附柱，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間加50μl洗脫緩沖液(Eluent)，室溫放置1min，13000rpm離心1min洗脫質(zhì)粒DNA，-20℃保存?zhèn)溆?.質(zhì)粒DNA的定量（紫外分光光度法）清洗比色皿：用微量加樣槍向比色皿加入適量的蒸餾水刷洗，2~3次。并用濾紙擦拭干凈清洗比色皿：用微量加樣槍向比色皿加入適量的蒸餾水刷洗，2~3次。并用濾紙擦拭干凈空白對照比色測定向比色皿加入98ul蒸餾水，進行Blank調(diào)零空白對照比色測定向比色皿加入98ul蒸餾水，進行Blank調(diào)零再向比色皿加入2ul的質(zhì)粒DNA，于紫外分光光度計上進行再向比色皿加入2ul的質(zhì)粒DNA，于紫外分光光度計上進行‘sample’測定，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)4.質(zhì)粒DNA的酶切鑒定在一個潔凈的1.5mlEP管中按順序依次加入下述試劑無菌水9.0μl、10×M酶切緩沖液2.0μl、質(zhì)粒DNA7.0μl、HindIII(15U/ul)1.0μl、EcoRI(12U/ul)1.0μl在一個潔凈的1.5mlEP管中按順序依次加入下述試劑無菌水9.0μl、10×M酶切緩沖液2.0μl、質(zhì)粒DNA7.0μl、HindIII(15U/ul)1.0μl、EcoRI(12U/ul)1.0μl小心混勻試劑，將EP小心混勻試劑，將EP管置于恒溫水浴箱中37℃1.5小時。取質(zhì)粒DNA、經(jīng)酶切反應(yīng)后的DNA片段和PCR擴增的DNA各6μl于三個EP管中并做好標(biāo)記取質(zhì)粒DNA、經(jīng)酶切反應(yīng)后的DNA片段和PCR擴增的DNA各6μl于三個EP管中并做好標(biāo)記往每個EP管中加入1往每個EP管中加入1μlGelview染料，室溫放置一分鐘用微量加樣槍分別各吸取10ul，按序號加入到電泳儀的凝膠孔中用微量加樣槍分別各吸取10ul，按序號加入到電泳儀的凝膠孔中電泳30分鐘電泳30分鐘取出凝膠取出凝膠紫外光下觀察，紫外光下觀察，拍照四、結(jié)果與討論：（一）實驗現(xiàn)象1.加入溶液P1，出現(xiàn)懸浮現(xiàn)象；2.加入溶液P2,溫和混勻，溶液會變得清亮；3.加入溶液P3,有白色絮狀沉淀生成；4.電泳時，可觀察到在電流作用下，點樣的溶液出現(xiàn)電泳現(xiàn)象，電泳速度不同。在紫外檢測儀條件下，可以觀察到不同的物質(zhì)出現(xiàn)不同的電泳帶。（二）實驗結(jié)果原始實驗數(shù)據(jù)測量次數(shù)質(zhì)粒DNA濃度（ug/ml）Ratio比值(A260/A280)11481.4621061.5231151.45平均值1231.47電泳后的圖片A:PCR目的條帶B:酶切片段C:質(zhì)粒DNA（四）實驗分析1.由上數(shù)據(jù)可知，Ratio=1.47A260/A280<1.8表明樣品中含有較多的蛋白質(zhì)（芳香族）2.在圖片中，其他三類DNA與Maker相比較，可知質(zhì)粒DNA的分子大小在2500bp-3500bp，酶切反應(yīng)的質(zhì)粒DNA片段分子大小在2800-3000bp和400-500左右，PCR的DNA分子大小在400-500bp。基本符合預(yù)期。（四）實驗討論1.質(zhì)粒DNA中出現(xiàn)三條帶，分別對應(yīng)超螺旋質(zhì)粒DNA、線性DNA和開環(huán)狀質(zhì)粒DNA。這三種不同構(gòu)型的分子有不同的遷移率，在一般情況下，遷移速度最快的為超螺旋型，其次為線性分子，最慢的為開環(huán)狀分子，所以條帶從上到下分別為：超螺旋型DNA、線性分子、開環(huán)狀分子。,2.對于實驗結(jié)果中：A260/A280<1.8的可能原因為：A.在質(zhì)粒DNA的提取實驗的“取上清液”步驟中吸入沉淀導(dǎo)致引入較多的蛋白雜質(zhì)，進而導(dǎo)致后續(xù)實驗中因蛋白質(zhì)量較多而難以去除。B.可能為試劑污染引起雜質(zhì)蛋白的引入。3.實驗中需注意的事項：用微量加樣槍加試劑時，同種試劑可以不用換吸頭，每次換不同試劑時要記得換一個新吸頭。在PCR中，如果配好的反應(yīng)液較多沾到管壁上，要將PCR反應(yīng)管置臺式離心機中瞬時離心，使反應(yīng)液集中于管底，然后才將反應(yīng)管放到基因擴增儀上。在質(zhì)粒DNA提取的實驗中，加入溶液S2時，時間不能太久，動作要溫柔，輕輕顛倒幾次。在電泳實驗中，點樣時槍頭下伸，點樣孔內(nèi)不能有氣泡。在電泳中，Geldview有毒，切勿用手接觸。思考題：（1）堿裂解法提取質(zhì)粒時，溶液I、II、III的作用分別為？答：溶液I：螯合金屬離子，抑制脫氧核酸酶對DNA的降解作用；有利于溶酶體的作用。溶液II：細(xì)胞壁肽聚糖在堿性下水解，核酸和蛋白質(zhì)變性。溶液III：酸性條件下質(zhì)粒DNA復(fù)性，變性蛋白-SDS+線性DNA沉淀，Na+可中和DNA。（2）結(jié)合實驗情況，如何提高限制性酶