人肝癌smmc-7721細胞培養(yǎng)技術的探索

人肝癌smmc-7721細胞培養(yǎng)技術的探索

目前，細胞培養(yǎng)技術已成為一項非常重要的生物技術之一。這是醫(yī)學和解熱劑開發(fā)的基礎技術，其作用不容忽視。人肝癌SMMC-7721細胞屬于肝癌細胞系,現已廣泛用于藥物毒理、抗腫瘤等方面的研究,目前關與人肝癌SMMC-7721細胞的培養(yǎng)文獻還比較少,我們對于人肝癌SMMC-7721細胞的培養(yǎng)條件和方法上進行了探索,現總結出一些經驗。1數據和方法1.1一般材料1.1.1實驗細胞1.1.2刑罰執(zhí)行和酶去除能力Dulbcco’sModifiedEagle’Medium(DMEM)培養(yǎng)基:北京賽默飛世爾生物化學制品有限公司磷酸鹽緩沖液(PBS):氯化鈉8.00g、十二水磷酸氫二鈉2.885g、氯化鉀0.20g、磷酸氫二鉀0.20、三蒸水配制,0.22μm濾膜過濾除菌,PH7.2~7.4,4℃保存。新生牛血清(NBCS):杭州四季青生物材料工程研究所-20℃保存,使用前4℃溶解,56℃滅活30min。胰蛋白酶消化液:胰蛋白酶(Trypsin1:250,GIBCO公司)用PBS液配制成濃度為0.25%溶液,0.22μm濾膜過濾除菌,4℃保存。青霉素、鏈霉素溶液:0.22μm濾膜過濾除菌,4℃保存。1.1.3光學顯微鏡、儀器系統二氧化碳培養(yǎng)箱:BB16UV德國Heraeus公司;超凈工作臺:VS-1300L型,蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限責任公司;倒置相差光學顯微鏡:IX71型,日本Olympus公司產品;恒溫水浴鍋:DZW-4型,金壇市恒豐儀器廠;純凈水系統:Milli-QBiocel美國Millipore公司;電熱恒溫干燥箱:風熱式,101型,北京科偉永鑫實驗儀器設備廠;臺式滅菌器:TMQ.J-2540型,山東新華醫(yī)療器械股份有限公司。1.2方法1.2.1細胞復蘇后分瓶將凍存的細胞用鑷子捏住在提前預熱的37℃水浴鍋中快速搖晃將細胞解凍,整個過程一般不要超過2min,然后將細胞用尖吸管轉移至細胞培養(yǎng)瓶中(復蘇的時候細胞最好不要分瓶),密度一般為1×101.2.2實驗室傳代的方法細胞一般鋪滿瓶底80%左右就可以進行傳代了。SMMC-7721細胞形態(tài)一般為花瓣狀,如果細胞數目過多未及時傳代可以觀察到細胞分為2層:上層為圓形細胞層,下層為花瓣形細胞層。我們實驗室采用的傳代的具體方法如下:先用已過濾的預冷PBS溶液洗細胞2次,再加入0.25%的胰酶溶液1mL來回輕晃培養(yǎng)瓶用封口膜封口后在顯微鏡下觀察,待大部分細胞變圓后(一般2min左右)立刻豎起培養(yǎng)瓶使細胞脫離胰酶溶液,經酒精擦拭拿回超凈臺,用尖吸管將胰酶吸出(此時盡量不要直接倒掉胰酶因為細胞經消化已經貼壁不牢了,直接倒掉會損失一部分細胞)。最后根據你要傳的瓶數加入相應的培養(yǎng)基用尖吸管吸取培養(yǎng)基從培養(yǎng)瓶爬滿細胞的那面由上往下吹打。我們一般采取1∶3的傳代方式,細胞生長良好,3d后長滿瓶底。1.2.3dmso凍存的方法在細胞生長良好的時期一般為對數生長期我們要對細胞進行凍存,如果實驗中出現污染可以提供健康的細胞來源。下面來談談凍存的方法:凍存前首先我們要配置凍存液,我們采用的凍存液的比例是1mL的凍存液中含0.5mL的血清、0.4mL的新鮮培養(yǎng)基、0.1mL的DMSO。剛配制的凍存液不能直接加入細胞內,因為DMSO會釋放出大量的熱會對細胞產生損傷。具體方法如下:將生長良好的SMMC-7721細胞(約為80%~90%致密度,濃度為1×102討論2.1離心法是否有效有些文獻2.2細胞吹下引流消化時如果單純用胰酶消化時間很難把握,若消化過度,細胞不容易貼壁,48h后仍不貼壁示為死細胞。若消化不完全用尖吸管吹打細胞很難吹下細胞。長時間吹打也會對細胞造成損傷,這樣傳代還會引起每瓶細胞數目不均一,用PBS洗后消化時間易于掌握,提高細胞的活力。2.3冷凍溶液的制備方法改進以往相關資料中2.4凍存方法不正確復蘇后的貼壁細胞24h后80%以上的細胞都會貼壁,不貼壁的細胞可能已經死亡,主要有以下3方面的原因:(1)凍存前的細胞已經存在污染;(2)凍存方法不正確主要可能是加入血清過少或者凍存溫度時間錯誤;(3)細胞復蘇時離心時間過長轉速過高或細胞貼壁后未及時去除凍存液從而對細胞造成損傷。一般SMMC-7721細胞在復蘇后4d左右貼壁率達90﹪以上,就可進行傳代,傳代后的細胞生長較迅速,3d左右基本可以鋪滿瓶底,經過2、3次傳代細胞穩(wěn)定后,生長狀態(tài)良好時就可以對細胞進行臨床毒理性試驗研究、細胞核型分析、及提取總蛋白進行蛋白印記分析等各種操作。3建立以各因素存在的基本流程為基礎的的流程在人肝癌SMMC-7721細胞培養(yǎng)過程中最為關鍵的技術還是