人肝癌smmc-7721細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的探索

人肝癌smmc-7721細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的探索

目前，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已成為一項(xiàng)非常重要的生物技術(shù)之一。這是醫(yī)學(xué)和解熱劑開發(fā)的基礎(chǔ)技術(shù)，其作用不容忽視。人肝癌SMMC-7721細(xì)胞屬于肝癌細(xì)胞系,現(xiàn)已廣泛用于藥物毒理、抗腫瘤等方面的研究,目前關(guān)與人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的培養(yǎng)文獻(xiàn)還比較少,我們對(duì)于人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的培養(yǎng)條件和方法上進(jìn)行了探索,現(xiàn)總結(jié)出一些經(jīng)驗(yàn)。1數(shù)據(jù)和方法1.1一般材料1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞1.1.2刑罰執(zhí)行和酶去除能力Dulbcco’sModifiedEagle’Medium(DMEM)培養(yǎng)基:北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司磷酸鹽緩沖液(PBS):氯化鈉8.00g、十二水磷酸氫二鈉2.885g、氯化鉀0.20g、磷酸氫二鉀0.20、三蒸水配制,0.22μm濾膜過濾除菌,PH7.2~7.4,4℃保存。新生牛血清(NBCS):杭州四季青生物材料工程研究所-20℃保存,使用前4℃溶解,56℃滅活30min。胰蛋白酶消化液:胰蛋白酶(Trypsin1:250,GIBCO公司)用PBS液配制成濃度為0.25%溶液,0.22μm濾膜過濾除菌,4℃保存。青霉素、鏈霉素溶液:0.22μm濾膜過濾除菌,4℃保存。1.1.3光學(xué)顯微鏡、儀器系統(tǒng)二氧化碳培養(yǎng)箱:BB16UV德國Heraeus公司;超凈工作臺(tái):VS-1300L型,蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限責(zé)任公司;倒置相差光學(xué)顯微鏡:IX71型,日本Olympus公司產(chǎn)品;恒溫水浴鍋:DZW-4型,金壇市恒豐儀器廠;純凈水系統(tǒng):Milli-QBiocel美國Millipore公司;電熱恒溫干燥箱:風(fēng)熱式,101型,北京科偉永鑫實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠;臺(tái)式滅菌器:TMQ.J-2540型,山東新華醫(yī)療器械股份有限公司。1.2方法1.2.1細(xì)胞復(fù)蘇后分瓶將凍存的細(xì)胞用鑷子捏住在提前預(yù)熱的37℃水浴鍋中快速搖晃將細(xì)胞解凍,整個(gè)過程一般不要超過2min,然后將細(xì)胞用尖吸管轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中(復(fù)蘇的時(shí)候細(xì)胞最好不要分瓶),密度一般為1×101.2.2實(shí)驗(yàn)室傳代的方法細(xì)胞一般鋪滿瓶底80%左右就可以進(jìn)行傳代了。SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)一般為花瓣?duì)?如果細(xì)胞數(shù)目過多未及時(shí)傳代可以觀察到細(xì)胞分為2層:上層為圓形細(xì)胞層,下層為花瓣形細(xì)胞層。我們實(shí)驗(yàn)室采用的傳代的具體方法如下:先用已過濾的預(yù)冷PBS溶液洗細(xì)胞2次,再加入0.25%的胰酶溶液1mL來回輕晃培養(yǎng)瓶用封口膜封口后在顯微鏡下觀察,待大部分細(xì)胞變圓后(一般2min左右)立刻豎起培養(yǎng)瓶使細(xì)胞脫離胰酶溶液,經(jīng)酒精擦拭拿回超凈臺(tái),用尖吸管將胰酶吸出(此時(shí)盡量不要直接倒掉胰酶因?yàn)榧?xì)胞經(jīng)消化已經(jīng)貼壁不牢了,直接倒掉會(huì)損失一部分細(xì)胞)。最后根據(jù)你要傳的瓶數(shù)加入相應(yīng)的培養(yǎng)基用尖吸管吸取培養(yǎng)基從培養(yǎng)瓶爬滿細(xì)胞的那面由上往下吹打。我們一般采取1∶3的傳代方式,細(xì)胞生長良好,3d后長滿瓶底。1.2.3dmso凍存的方法在細(xì)胞生長良好的時(shí)期一般為對(duì)數(shù)生長期我們要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行凍存,如果實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)污染可以提供健康的細(xì)胞來源。下面來談?wù)剝龃娴姆椒?凍存前首先我們要配置凍存液,我們采用的凍存液的比例是1mL的凍存液中含0.5mL的血清、0.4mL的新鮮培養(yǎng)基、0.1mL的DMSO。剛配制的凍存液不能直接加入細(xì)胞內(nèi),因?yàn)镈MSO會(huì)釋放出大量的熱會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷。具體方法如下:將生長良好的SMMC-7721細(xì)胞(約為80%~90%致密度,濃度為1×102討論2.1離心法是否有效有些文獻(xiàn)2.2細(xì)胞吹下引流消化時(shí)如果單純用胰酶消化時(shí)間很難把握,若消化過度,細(xì)胞不容易貼壁,48h后仍不貼壁示為死細(xì)胞。若消化不完全用尖吸管吹打細(xì)胞很難吹下細(xì)胞。長時(shí)間吹打也會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷,這樣傳代還會(huì)引起每瓶細(xì)胞數(shù)目不均一,用PBS洗后消化時(shí)間易于掌握,提高細(xì)胞的活力。2.3冷凍溶液的制備方法改進(jìn)以往相關(guān)資料中2.4凍存方法不正確復(fù)蘇后的貼壁細(xì)胞24h后80%以上的細(xì)胞都會(huì)貼壁,不貼壁的細(xì)胞可能已經(jīng)死亡,主要有以下3方面的原因:(1)凍存前的細(xì)胞已經(jīng)存在污染;(2)凍存方法不正確主要可能是加入血清過少或者凍存溫度時(shí)間錯(cuò)誤;(3)細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)離心時(shí)間過長轉(zhuǎn)速過高或細(xì)胞貼壁后未及時(shí)去除凍存液從而對(duì)細(xì)胞造成損傷。一般SMMC-7721細(xì)胞在復(fù)蘇后4d左右貼壁率達(dá)90﹪以上,就可進(jìn)行傳代,傳代后的細(xì)胞生長較迅速,3d左右基本可以鋪滿瓶底,經(jīng)過2、3次傳代細(xì)胞穩(wěn)定后,生長狀態(tài)良好時(shí)就可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行臨床毒理性試驗(yàn)研究、細(xì)胞核型分析、及提取總蛋白進(jìn)行蛋白印記分析等各種操作。3建立以各因素存在的基本流程為基礎(chǔ)的的流程在人肝癌SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)過程中最為關(guān)鍵的技術(shù)還是