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葉綠體色素提取和分離實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)
“提取和分離葉綠化劑”實(shí)驗(yàn)是在高等教育的三個(gè)專業(yè)生化系的“植物生物化學(xué)”課程中進(jìn)行的一個(gè)實(shí)驗(yàn)。這也是高中生物實(shí)驗(yàn)中最困難的一個(gè)。該實(shí)驗(yàn)的目的在于驗(yàn)證葉綠體色素的種類及性質(zhì)、葉綠體色素在植物光合作用中的作用,加深對(duì)光合作用相關(guān)內(nèi)容的理解。但在實(shí)驗(yàn)中,常因?qū)嶒?yàn)材料中色素含量低、提取制備較難、層析分離后色帶清晰度差、甚至色帶種類不全等諸多因素,最后影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。作為師范院校的學(xué)生必須把這個(gè)實(shí)驗(yàn)的原理、方法、難點(diǎn)理解透徹,為將來從事教學(xué)打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。筆者在講解實(shí)驗(yàn)原理及操作的過程中緊緊抓住幾個(gè)為什么,同時(shí)針對(duì)實(shí)驗(yàn)成敗關(guān)鍵之處,如葉綠體色素的提取、過濾與點(diǎn)樣,根據(jù)多年的實(shí)踐,并參考有關(guān)的資料進(jìn)行一些改進(jìn),取得了很好的實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果。1.種色索分離原理葉綠體色素分離的實(shí)驗(yàn)原理是:葉綠體中的色素在層析液中的溶解度不同,溶解度高的隨層析液在濾紙上擴(kuò)散得快;溶解度低的隨層析液在濾紙上擴(kuò)散得慢。這樣幾分之后,葉綠體中的色素就在擴(kuò)散過程中分離開來。其中胡蘿卜素在丙酮中的溶解度最高,擴(kuò)散速度最快,葉黃素和葉綠素a次之,葉綠素b溶解度最低,擴(kuò)散得最慢。由此原理推斷,得到色素分離的濾紙圖應(yīng)為:胡蘿卜素的溶解度最大,其在層析液中的含量最多,所以在色素帶分離中形成的色素帶幅度應(yīng)最高、最寬,葉黃素和葉綠素a次之,葉綠素b的溶解度最低,在層析液中的含量最少,在色素帶分離中形成的色素帶應(yīng)最低、最窄。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到的圖形卻是:擴(kuò)散最快且位置最高的是胡蘿卜素,其含量最低,色素帶幅度最窄;而最慢的葉綠素b的色素帶次寬,顯示其含量次多;次慢的葉綠素a的色素帶最寬,顯示其含量最高。是什么原因造成這種差異呢?實(shí)際上單以色素在層析液中的溶解度高低來解釋色素的分離是行不通的,還需要從色素的分子結(jié)構(gòu)、分子量方面去解釋,即色索分離的原理,四種色素在層析液中的含量不同,因分子量大小的不同、分子極性的不同,而隨層析液在濾紙上的擴(kuò)散速度不同,其中胡蘿卜素的分子量最小,極性最弱,含量最少,擴(kuò)散速度最快,色素帶幅度最窄,葉黃素次之,葉綠素b的分子量最大,極性最強(qiáng),擴(kuò)散速度最慢。葉綠素a因其單位葉片量中的含量最多而色素帶帶幅最寬。2.實(shí)驗(yàn)中的一些原因只要我們理解了實(shí)驗(yàn)中的幾個(gè)為什么,就抓住了這個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的整個(gè)核心,真正弄懂了本次實(shí)驗(yàn)。2.1.體色素和丙酮為有機(jī)溶劑研磨時(shí)加入丙酮,起到提取色素的作用。因?yàn)槿~綠體色素是脂溶性的,易溶于有機(jī)溶劑,而丙酮是有機(jī)溶劑。丙酮之所以能提取出色素,是由于丙酮分子能通過范德華力與色素分子相互吸引而溶解色素。2.2.研磨研磨目在提取色素研磨時(shí),要加入少許石英砂,其目的是為了使研磨更充分。實(shí)際上石英砂就是二氧化硅,研磨時(shí)可以增大強(qiáng)度,加快細(xì)胞和葉綠體中的色素釋放。2.3.中和細(xì)胞液的酸性在提取色素研磨的過程中加入少許碳酸鈣是為了防止在研磨時(shí)葉綠體中的色素受到破壞。實(shí)際上,葉綠體中的色素所處的環(huán)境具有微堿性。實(shí)驗(yàn)中由于研磨會(huì)使細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞,細(xì)胞液(具有微酸性)流出,酸性的細(xì)胞液就會(huì)直接與葉綠體中的色素接觸,致使葉綠素的分子結(jié)構(gòu)遭到破壞,這是因?yàn)槿~綠素是一種含鎂的化合物,其中的鎂易被氫離子、二價(jià)銅離子、鋅離子等取代。形成去鎂葉綠素,使葉綠素失鎂,呈黃褐色。而碳酸鈣是強(qiáng)堿弱酸鹽,碳酸鈣在水中的溶解度很小,但還是能溶解,呈現(xiàn)一種弱堿性,中和了細(xì)胞液的酸性,保護(hù)了葉綠體的色素。如果我們把不加碳酸鈣的色素提取液和相同條件加碳酸鈣的色素提取液加塞后放在暗處放置幾小時(shí),前者變黃而后者無顯著變化,說明前者葉綠體色素容易遭到破壞,證明碳酸鈣的確能夠防止色素的破壞。2.4.濾紙條的形態(tài)轉(zhuǎn)化若不剪去濾紙條的兩角,色素帶的兩邊和中間不是在一條直線上。這是由于位于濾紙條兩邊的溶劑分子可以向三個(gè)方向散失,色素向上“跑”的速度較快。而濾紙條中間的溶劑分子只能有兩個(gè)方向散失,分別是向內(nèi)和向外,因而色素會(huì)“跑”的較慢。而現(xiàn)在剪去濾紙條的兩個(gè)角,可以在一定程度上加快中間色素的擴(kuò)散速度,減慢兩邊色素的擴(kuò)散速度,從而在實(shí)驗(yàn)中獲得比較理想的色素帶。在層析中加入少許無水硫酸鈉的原因在于無水硫酸鈉起著干燥劑的作用,對(duì)色素提取液進(jìn)行吸水處理,使提取液濃度提高,使實(shí)驗(yàn)效果更為明顯。加入無水硫酸鈉的另一作用是增大層析液的極性、延緩層析分離速度。3.對(duì)實(shí)驗(yàn)方法的改良通過查閱文獻(xiàn)資料,再參考筆者多年的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),針對(duì)實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵之處,如實(shí)驗(yàn)材料的選擇、提取液色素含量的高低、色素提取的難易、點(diǎn)樣是否均勻、層析劑等,對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行改良3.1.柱層析分離法葉綠體色素分離提取方法有紙層析法、溶液分離法和柱層析分離法。紙層析法中四種色素能清晰分辨;溶液分離法胡蘿卜素不易分辨;柱層析分離法葉綠素a、b明顯,葉黃素較淺。我們采用紙層析法。其分離裝置如下圖所示:其中的濾紙條長(zhǎng)度應(yīng)與燒杯相應(yīng),而泡沫塞是用小刀將泡沫切成與木板蓋上的圓孔大小相應(yīng),且用鋼鋸條在其下端中央鋸一條縫,深度為泡沫塞的3.2.上有綠化的植物葉片關(guān)于實(shí)驗(yàn)材料,有關(guān)教材或?qū)嶒?yàn)指導(dǎo)書中大多選用的是菠菜,但菠菜有季節(jié)性限制。通過筆者多年的比較研究,發(fā)現(xiàn)實(shí)際上有很多植物的葉片均可作為實(shí)驗(yàn)材料,但植物葉片必須是鮮綠的,且不宜是革質(zhì)或蠟質(zhì)的,也就是機(jī)械組織、纖維素較少、葉綠素含量高的種類。有的文章報(bào)道采用油菜、芹菜、菊花,我們實(shí)驗(yàn)室采用的是菠菜,只不過我們要把菠菜放在45的烘箱里烘40多分鐘,使菠菜的水分失掉一半為宜,放置冷卻,這樣就減少了菠菜的含水量,利于色素的分離和提取。3.3.丙酮研磨法常用的提取液為丙酮,書上要求加入量為15毫升,此量太大,容易造成提取液濃度太低,在實(shí)驗(yàn)中我們只加入6-8毫升的丙酮,分三次加入:首先在研磨中加入2毫升丙酮,迅速而充分地研磨,研成黃綠色漿后;再加入2毫升丙酮,繼續(xù)稍緩研磨,直到出現(xiàn)少量藍(lán)綠色液體。將研磨液倒入漏斗過濾之;最后用2毫升丙酮沖洗研缽和研臼,沖洗液也可倒入漏斗。在以上過程中,丙酮分三次加入,既可減少丙酮用量,又有利于葉綠體色素充分溶解于丙酮。在研磨的過程中我們可以加入少量的氯化鈉,因氯化鈉是強(qiáng)電解質(zhì),其原理在于:鹽在水中電離成離子,這些離子的半徑較小,而且?guī)в姓?fù)電荷,和水的親合力大于有機(jī)分子與水的親合力,故鹽對(duì)水分子的吸引力大于水分子和有機(jī)溶劑分子之間氫鍵的力量,所以能把水和有機(jī)溶劑分開。3.4.濾液濃度不一形成帶谷傳統(tǒng)的濾紙條點(diǎn)樣方法是用細(xì)毛細(xì)管進(jìn)行點(diǎn)樣,但由于操作者的操作水平,而造成劃線不是很細(xì)、點(diǎn)樣不是很均勻,造成濾液細(xì)線上的濃度不一,從而影響色帶形狀:高處形成一個(gè)峰,低處形成帶谷。其主要原因是濾液細(xì)線上的濃度不一,濃度大處,色素溶解慢,隨層析液上升一段距離后再分離,色素分離晚,形成帶峰;濃度低處分離早,形成帶谷。針對(duì)這種方法的不足,我們經(jīng)過摸索,覺得用以下方法實(shí)驗(yàn)效果比較好:用烘干的濾紙條沿著去角一端的梯形長(zhǎng)底邊(距濾紙條頂端的1-1.5厘米處)對(duì)折輕壓,然后用折縫輕蘸一下培養(yǎng)皿中
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