面包中耐輻射菌種的分離鑒定及敏感性研究

面包中耐輻射菌種的分離鑒定及敏感性研究

面包是人們日常生活中最常見的食物。然而市售面包的貨架期通常很短,這給面包的商業(yè)化流通帶來一定的難度,對于軍隊、登山、探險、航海等特殊行業(yè),就更需要一種儲存時間長且品質有保證的主食面包。目前對于面包的保藏性研究多集中于添加防腐劑,調整水活和酸度等化學方法因此,本實驗嘗試利用射線輻照面包以延長保質期,并實現(xiàn)商業(yè)化流通的目標。面包儲存時間過長,會出現(xiàn)發(fā)霉、發(fā)粘、牽絲的現(xiàn)象,面包上滋長的主要微生物有:青霉、曲霉、馬鈴薯桿菌、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌等本研究采用劃線分離方法和API菌種鑒定系統(tǒng)對輻照面包中主要微生物菌群進行分離和鑒定,得到輻照面包中的耐輻射菌種。同時,采用感染實驗研究以面包為生長介質時不同濃度的兩種耐輻射菌對輻照處理的敏感性。研究旨在為面包選擇合適的輻照殺菌劑量,為進一步采取更加有效的復合措施抑制耐輻射菌種提供理論依據,進而大幅度延長面包的保質期,達到商業(yè)化流通的目的。1材料和方法1.1細菌鑒定系統(tǒng)面包制作原輔料,均為市售。常用設備與材料包括攪拌機、恒溫恒濕箱、醒發(fā)箱、烤箱、封口機、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、漩渦振蕩器、顯微鏡、接種針、2mL一次性注射器等。營養(yǎng)瓊脂,革蘭氏染色試劑,芽孢染色試劑,氧化酶試劑,觸酶試劑,無菌生理鹽水等。細菌鑒定系統(tǒng)采用法國bioMérieux公司API50CHB芽孢桿菌鑒定系統(tǒng)和APIStaph葡萄球菌和微球菌鑒定系統(tǒng)。使用法國bioMérieux公司APILabPlusV3.0和V4.0分析軟件。中國農業(yè)科學院農產品加工研究所輻照中心提供輻照源1.2實驗方法1.2.1發(fā)酵、515e的面團將面粉、酵母、糖、鹽倒入攪拌機中,緩慢加水,低速攪拌4min,使混合均勻,成團,加入油脂,高速攪拌約15min至面筋完全形成。將面團置于溫度為(30±2)℃,相對濕度為85%的醒發(fā)箱中發(fā)酵60min,翻面后發(fā)酵40min,取出,定量切割成(70±1)g重量的面團,搓圓,中間醒發(fā)15min。整型后置于(35±2)℃的醒發(fā)箱中醒發(fā)40min,取出后焙烤約16min至表面金黃,面火和底火均為210℃,出爐后室溫冷卻90min,鋁箔袋熱封包裝。1.2.2輻射樣品的采集和處理自制面包經1kGy輻照,37℃恒溫培養(yǎng)箱放置1周,使之均勻長菌(使面包的帶菌濃度約為101.2.3菌株劃分及純化從適當稀釋度的平板上,挑取各菌種典型生長的單個菌落,然后在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上反復進行劃線分離,根據菌落形態(tài)及染色鏡檢情況,連續(xù)劃線培養(yǎng)至得到純化的單菌落。1.2.4分析和利用有機碳質材料(1)芽孢桿菌的鑒定:革蘭氏染色、芽孢形態(tài)、氧化酶、觸酶試驗參照《食品微生物檢驗手冊》碳水化合物的利用:使用API50CHB芽孢桿菌鑒定系統(tǒng),選用49種不同的碳水化合物為底物進行測定。分離的菌種經純種擴大培養(yǎng),制成一定濃度的菌懸液(濁度達到2McF),取該菌懸液0.2mL混入10mL的API50CHB培養(yǎng)基(No.50430,bioMérieux,France)中,再分別接種到49種不同的碳水化合物底物上,在30℃條件下培養(yǎng)48h,并分別在24h和48h時記錄結果。結果通過軟件APILabsoftwareV3.0(bioMérieux,France)進行分析,并與伯杰細菌鑒定手冊(2)G碳水化合物的利用:使用APIStaph葡萄球菌和微球菌鑒定系統(tǒng),選用20種不同的碳水化合物為底物進行測定。分離的菌種經純種擴大培養(yǎng),在APIStaph培養(yǎng)基中制成一定濃度的菌懸液(濁度達到0.5McF),再分別接種到20種不同的碳水化合物底物上,在37℃條件下培養(yǎng)24h,記錄結果。結果通過軟件APILabsoftwareV4.0(bioMérieux,France)進行分析,并與伯杰細菌鑒定手冊1.2.5兩種懸浮液的制備分別用無菌生理鹽水洗下兩種菌的菌苔,經漩渦振蕩器充分混勻后,分別配制成高、低兩個濃度(高濃度為101.2.6安全檢測每個鋁箔袋中裝入自制面包一塊(25±1)g,封口后用20kGy的劑量進行照射,隨機取樣進行檢測,證明面包經20kGy的高劑量輻照后可以達到無菌狀態(tài)。用2mL一次性注射器在每塊無菌面包的多個位置上分多次注入1mL已配制好的菌懸液1.2.8計算方法的測試用平皿傾注稀釋分離法進行計數1.2.9數據分析的方法應用Excel2003對數據進行統(tǒng)計分析。2結果與討論2.1芽孢桿菌的分離培養(yǎng)通過劃線分離得到一種純菌種,經革蘭氏染色后,在顯微鏡油鏡下觀察菌體的個體結構、菌落形態(tài)和生理生化特性,觀察和實驗結果見圖1、2和表1。通過該菌株在顯微鏡下的菌體形態(tài)、染色情況,結合菌落特征及生理生化特征,可以初步鑒定為芽孢桿菌。如表2所示,初步鑒定的芽孢桿菌可以利用API50CHB試劑條中的甘油等26種碳水化合物,與枯草芽孢桿菌的模式菌株比較,對碳水化合物利用情況十分相似。經過APILabV3.0軟件分析,輻照面包中分離純化所得芽孢桿菌可鑒定為枯草芽孢桿菌,鑒定百分率為85.2%,評語為“好的鑒定”,枯草芽孢桿菌的相似度T為0.79,說明分離到的枯草芽孢桿菌與標準菌有很好的相似度。將分離和鑒定的菌株采用斜面培養(yǎng)基保存,作為下一步染菌實驗的接種用菌。2.2個體結構、菌落形態(tài)和生理生化反應通過劃線分離得到另一種純菌種,經革蘭氏染色后,在顯微鏡油鏡下觀察菌體的個體結構、菌落形態(tài)和生理生化反應,觀察和實驗結果見圖3、4和表3。通過該菌株在顯微鏡下的菌體形態(tài)、染色情況,結合菌落特征及生理生化特征,可以初步鑒定為G由表4所示,初步鑒定的觸酶陽性G輻照面包中分離得到的G2.3輻照處理對活菌計數的影響為進一步了解輻照處理對枯草芽孢桿菌和克氏微球菌的殺滅效果,將分離純化所得兩種耐輻射菌種在面包上做感染實驗,再以不同劑量進行輻照,然后分別對活菌計數,得出各菌的殺菌曲線以考察其對輻照處理的敏感性。由圖5、6可明顯地看出,輻照處理對面包具有很好的殺菌效果,3kGy的輻照劑量就可以使兩種耐輻射菌的菌數減少3～4個對數值,同時隨著輻照劑量的增加,滅菌效果越好,輻照劑量與存活菌數呈現(xiàn)明顯的線性關系,檢測結果經線性擬合,可得出面包中兩種耐輻射菌的輻照劑量與存活菌數的直線回歸方程。微生物對射線的敏感性常用D3輻照面包的微生物發(fā)酵本研究通過劃線分離方法和API菌種鑒定系統(tǒng)對輻照面包中主要微生物菌群進行分離和鑒定,得出枯草芽孢桿菌和克氏微球菌是輻照面包上的最耐輻照菌種。輻照面包中,