微生物培養(yǎng)基

第一節(jié)培養(yǎng)基選擇和配制的原則培養(yǎng)基是人工配制的供微生物或動植物細(xì)胞生長繁殖和合成各種代謝產(chǎn)物所需要的、一定比例的多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物，同時(shí)培養(yǎng)基也為微生物等提供除營養(yǎng)外的其他生長所必須的環(huán)境條件。培養(yǎng)基組成對菌體生長繁殖、產(chǎn)物的生物合成、產(chǎn)品的分離精制乃至產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量都有重要的影響。所有發(fā)酵培養(yǎng)基都必須提供微生物生長繁殖和產(chǎn)物合成所需的碳源、氮源、無機(jī)元素、生長因子、水和氧氣等。大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)中還必須重視培養(yǎng)基原料的價(jià)格和來源。一、培養(yǎng)基的類型和用途根據(jù)來源分：根據(jù)主要成分或使用目的分：根據(jù)生產(chǎn)工業(yè)的要求分：天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基半合成培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基孢子培養(yǎng)基——供制備孢子用；種子培養(yǎng)基——滿足菌種生長；發(fā)酵培養(yǎng)基——滿足大生產(chǎn)中大量菌體生長和繁殖以及代謝產(chǎn)物積累營養(yǎng)不能太豐富，尤其是有機(jī)氮源；無機(jī)鹽濃度要適量，否則會影響孢子量和孢子顏色；注意pH和濕度營養(yǎng)要求比較豐富和完全，氮源和維生素含量也要高一些除含有菌體生長所必須的營養(yǎng)物外，還要有產(chǎn)物所需的特定元素、前體物質(zhì)和促進(jìn)劑等二、培養(yǎng)基類型的選擇從微生物的特點(diǎn)來選擇液體和固體培養(yǎng)基選擇從生產(chǎn)實(shí)踐和科學(xué)試驗(yàn)的不同要求選擇從經(jīng)濟(jì)效益方面考慮選擇生產(chǎn)原料三、培養(yǎng)基的配制原則根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基注意速效碳（氮）源和緩效碳（氮）源的配合使用，發(fā)揮各自的優(yōu)勢營養(yǎng)成分的恰當(dāng)配比（C/N一般取100:0.2～2.0）滲透壓，營養(yǎng)物質(zhì)要有合適的濃度合適的pH值（注意生理酸性鹽、生理堿性鹽和緩沖劑的加入）氧化還原電位考慮營養(yǎng)成分的加入順序，避免生產(chǎn)沉淀四、培養(yǎng)基成分配比的選擇參照前人所使用的較適合于某一類菌種培養(yǎng)基的經(jīng)驗(yàn)配方結(jié)合所用菌種和產(chǎn)品的特性采用搖瓶、玻璃瓶等小型發(fā)酵設(shè)備，對碳、氮、無機(jī)鹽和前體等進(jìn)行逐個(gè)單因子試驗(yàn)觀察這些因子對菌體生長和產(chǎn)物合成量的影響綜合考慮各因素的影響得到一個(gè)適合該菌種的培養(yǎng)基配方以得到高產(chǎn)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)——減少試驗(yàn)次數(shù)，確定培養(yǎng)基組分和濃度方差分析——了解哪些因素影響大，以引起注意四、培養(yǎng)基成分配比的選擇氮源過多，菌體繁殖旺盛，pH值偏高，不利于代謝產(chǎn)物的積累；氮源不足，菌體繁殖量少，影響產(chǎn)量。碳源過多，容易形成較低的pH值；碳源不足，菌體衰老和自溶。C/N不當(dāng)影響菌體按比例吸收營養(yǎng)物質(zhì)，直接影響菌體生長和產(chǎn)物形成。注意速效碳、氮源和緩效碳、氮源的相互配合，選用適當(dāng)?shù)腃/N。一般發(fā)酵工業(yè)中C/N為100:（0.2～2.0）但對于氨基酸生產(chǎn)，由于產(chǎn)物中含氮較多，因此C/N就要適當(dāng)調(diào)整，如100:（15～21）第二節(jié)工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基消耗每克底物將產(chǎn)生最大的菌體得率或產(chǎn)物得率能產(chǎn)生最高的產(chǎn)品或菌體的濃度能以最大的速率產(chǎn)生產(chǎn)物副產(chǎn)品的得率最小價(jià)廉并具有穩(wěn)定的質(zhì)量來源豐富且供應(yīng)充足易于通氣和攪拌提取、純化、廢物處理等生產(chǎn)工藝過程都比較容易在發(fā)酵工業(yè)中，必須使用廉價(jià)的原料來配制培養(yǎng)基，使之盡可能滿足下列條件：發(fā)酵培養(yǎng)基例子代謝產(chǎn)物衣康酸赤霉素核黃素青霉素培養(yǎng)基甘蔗糖蜜，150g/L；ZnSO4，1.0g/L；MgSO4，3.0g/L；CuSO4，0.01g/L葡萄糖，20g/L；MgSO4，1.0g/L；NH4NO3，1.0g/L；KH2PO4，5.0g/L；FeSO4?7H2O，0.01g/L；MnSO4?4H2O，0.01g/L；ZnSO4?7H20，0.01g/L；CuSO4?5H2O，0.01g/L；玉米漿（干固形物），7.5g/L大豆油，20mL/L；甘油，20mL/L；葡萄糖，20g/L；玉米漿，12mL/L；酪蛋白，12g/L；KH2PO4，1.0g/L葡萄糖或糖蜜，總量的10％；玉米漿，總量的4％～5％；苯乙酸，總量的0.5％～0.8％；豬油或植物油；消泡劑，總量的0.5％一、工業(yè)上常用的碳源碳源來源葡萄糖純葡萄糖，水解淀粉乳糖純?nèi)樘牵榍宸鄣矸鄞篼?，花生粉，燕麥粉，黑麥粉，大豆粉等蔗糖甜菜糖蜜，甘蔗糖蜜，粗紅糖，精白糖等在微生物發(fā)酵過程中，普遍以碳水化合物作為碳源。生產(chǎn)疫苗時(shí)通常用牛血清蛋白、牛肉汁等蛋白質(zhì)作為碳源。酒精、簡單的有機(jī)酸、烷烴等含碳物質(zhì)也可作為碳源。甲醇作為底物生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白（SCP）用烷烴進(jìn)行有機(jī)酸、維生素等的生產(chǎn)碳源供給菌體生命活動所需的能量和構(gòu)成菌體細(xì)胞以及代謝產(chǎn)物。二、工業(yè)上常用的氮源無機(jī)氮源：氨水，銨鹽，硝酸鹽等有機(jī)氮源：玉米漿，豆餅粉，花生餅粉，棉籽粉，魚粉，酵母浸出液等氮源主要構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)，作為酶的組成成分或維持酶的活性，調(diào)節(jié)滲透壓、pH、Eh等。工業(yè)上常用的氮源及含氮量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%）氮源含氮量氮源含氮量大麥1.5～2.0花生粉8.0甜菜糖蜜1.5～2.0燕麥粉1.5～2.0甘蔗糖蜜1.5～2.0大豆粉8.0玉米漿4.5乳清粉4.5三、無機(jī)鹽無機(jī)鹽是微生物活動不可缺少的物質(zhì)。其主要功能是構(gòu)成菌體成分、作為酶的組成部分、酶的激活劑或抑制劑、調(diào)節(jié)培養(yǎng)滲透壓、調(diào)節(jié)pH值和Eh等。微生物對無機(jī)鹽的需要量很少，但無機(jī)鹽含量對菌體生長和產(chǎn)物的生成影響很大。磷酸鹽硫酸鎂鉀鹽微量元素磷是某些蛋白質(zhì)和核酸的組成成分。磷酸鹽在培養(yǎng)基中還具有緩沖作用。工業(yè)上常用K3PO4?3H2O、K3PO4和Na2HPO4?12H2O、NaH2PO4?2H2O等磷酸鹽，也可用磷酸。①除了組成某些細(xì)胞的葉綠素成分外，并不參與任何細(xì)胞物質(zhì)的合成；②處于離子狀態(tài)時(shí)，是許多重要的酶（己糖磷酸化酶，檸檬酸脫氫酶、羧化酶等）的激活劑；③不但影響基質(zhì)的氧化，還影響蛋白質(zhì)的合成①鉀離子與細(xì)胞滲透壓和透性有關(guān)；②是許多酶的激活劑；③促進(jìn)糖代謝①Zn、Co、Mn、Cu等元素大部分作為酶的輔基和激活劑；②一般作為碳、氮源的農(nóng)副產(chǎn)品天然原料中，本身就含有某些微量元素，不必另加；③特例：VB12的生產(chǎn)，由于鈷是其組成成分，Co的需要量隨產(chǎn)物的增加而增加，因此在培養(yǎng)基中需加入氯化鈷以補(bǔ)充鈷四、生長因子從廣義來說，凡是微生物不可缺少的微量有機(jī)物質(zhì)，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等均稱為生長因子。其功能是構(gòu)成細(xì)胞的組成分，促進(jìn)生命活動的進(jìn)行。生長因子不是所有微生物都必需的，它只是對于某些自己不能合成這些成分的微生物才是必不可少的營養(yǎng)物。目前以糖質(zhì)原料為碳源的谷氨酸產(chǎn)生菌均為生物素缺陷型，以生物素為生長因子。提供生長因子的農(nóng)副產(chǎn)品原料玉米漿麩皮水解液糖蜜酵母：可用酵母膏、酵母浸出液或直接用酵母粉。五、前體物質(zhì)和促進(jìn)劑1.前體物質(zhì)某些化合物加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過程結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，而其自身結(jié)構(gòu)并沒有多大變化，但產(chǎn)物的量卻因加入而有較大的提高。有些氨基酸、核苷酸和抗生素發(fā)酵必須添加前體物質(zhì)才能獲得較高的產(chǎn)率。氨基酸發(fā)酵的前體物質(zhì)氨基酸菌體前體物質(zhì)產(chǎn)量/%絲氨酸嗜甘油棒狀桿菌甘氨酸1.6色氨酸異常漢遜酵母氨茴酸0.8色氨酸麥角菌吲哚1.3蛋氨酸脫氫極毛桿菌2-羥基4-甲基硫代丁醇1.1異亮氨酸粘質(zhì)賽桿菌α-氨基丁酸0.8異亮氨酸阿氏棒狀桿菌D-蘇氨酸1.5蘇氨酸谷氨酸小球菌高絲氨酸2.0抗生素發(fā)酵常用的前體物質(zhì)抗生素前體物質(zhì)抗生素前體物質(zhì)青霉素G苯乙酸或在發(fā)酵中能形成苯乙酸的物質(zhì)，如乙基酰胺等金霉素氯化物青霉素O烯丙基－硫基乙酸溴四環(huán)素溴化物青霉素V苯氧乙酸紅霉素丙酸、丙醇、丙酸鹽、乙酸鹽放線菌素C3肌氨酸灰黃霉素氯化物鏈霉素肌醇、精氨酸、甲硫氨酸2.發(fā)酵過程中的促進(jìn)劑和抑制劑在氨基酸、抗生素和酶制劑發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)過程中，可以在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入某些對發(fā)酵起一定促進(jìn)作用的物質(zhì)，稱為促進(jìn)劑或抑制劑。常用促進(jìn)劑表面活性劑——洗凈劑（脂肪酰胺磺酸鈉）、吐溫80、植酸等二乙胺四乙酸大豆油抽提物黃血鹽甲醇促進(jìn)劑能促進(jìn)產(chǎn)量增加的原因：主要是改進(jìn)了細(xì)胞的滲透性，增強(qiáng)了氧的傳遞速度，改善了菌體對氧的有效利用。在酶制劑發(fā)酵過程中，加入某些誘導(dǎo)物、表面活性劑及其他一些產(chǎn)酶促進(jìn)劑，可以大大增加菌體的產(chǎn)酶量?？股毓I(yè)在發(fā)酵過程中加入某些促進(jìn)劑或抑制劑，?？纱龠M(jìn)抗生素的生物合成?？股氐囊种苿┛股乇灰种频漠a(chǎn)物抑制劑鏈霉素甘露糖鏈霉素甘露聚糖去甲基鏈霉素鏈霉素乙硫氨酸四環(huán)素金霉素溴化物、巰基苯并噻唑、硫脲嘧啶、硫脲去甲基金霉素金霉素磺胺化合物、乙硫氨酸頭孢菌素C頭孢菌素NL-蛋氨酸利福霉素B其他利福霉素巴比妥藥物不同促進(jìn)劑所起的作用：起生長因素的作用；可推遲菌體的自溶；抑制某些合成其他產(chǎn)物的途徑而使之向所需產(chǎn)物的途徑轉(zhuǎn)化；降低了生產(chǎn)菌的呼吸，使之有利于抗生素的合成；改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，改善通氣效果；可與抗生素形成復(fù)鹽，降低發(fā)酵液中抗生素的濃度和促進(jìn)抗生素的合成等。第三節(jié)培養(yǎng)基的滅菌在工業(yè)微生物培養(yǎng)過程中，只允許生產(chǎn)菌存在和生長繁殖，不允許其它微生物共存，因此所有發(fā)酵過程，必須進(jìn)行純種培養(yǎng)整個(gè)發(fā)酵過程必須牢固樹立無菌觀念，強(qiáng)調(diào)無菌操作除了設(shè)備應(yīng)嚴(yán)格按規(guī)定保證沒有死角，沒有構(gòu)成染菌可能的因素外，必須對培養(yǎng)基和生產(chǎn)環(huán)境進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌和消毒，防止雜菌和噬菌體的污染滅菌：利用物理和化學(xué)的方法殺滅或除去物料及設(shè)備中一切生命物質(zhì)的過程。消毒：用物理或化學(xué)的方法殺死物料、容器、器具內(nèi)外的病原微生物，一般只能殺死營養(yǎng)細(xì)胞而不能殺死芽胞。消毒不一定能達(dá)到滅菌的要求，而滅菌則可達(dá)到消毒的目的。在發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中，為了保證純種培養(yǎng)，在生產(chǎn)菌種接種培養(yǎng)前，要對培養(yǎng)基、空氣系統(tǒng)、消泡劑、流加物料、設(shè)備、管道等進(jìn)行滅菌，還要對生產(chǎn)環(huán)境進(jìn)行消毒，防止雜菌和噬菌體的大量繁殖。只有不受雜菌污染，發(fā)酵過程才能正常進(jìn)行。一、滅菌的方法干熱滅菌法火焰滅菌法電磁波、射線滅菌法濕熱滅菌法（主要是高壓蒸汽滅菌）化學(xué)藥劑滅菌法過濾除菌法進(jìn)行干熱滅菌時(shí)，微生物細(xì)胞發(fā)生氧化，微生物體內(nèi)蛋白質(zhì)變性和電解質(zhì)濃縮引起中毒等作用，氧化作用導(dǎo)致微生物死亡是主要依據(jù)。由于微生物對于熱的耐受力比對濕熱強(qiáng)得多，故干熱滅菌所需的溫度要高，時(shí)間要長，一般160～170℃、1～1.5h。實(shí)際應(yīng)用時(shí)，對一些要求保持干燥的實(shí)驗(yàn)器具和材料可以采用干熱滅菌法。利用火焰直接殺死微生物的滅菌法稱為火焰滅菌法。該法方法簡單，滅菌徹底，但使用范圍有限，僅適用于接種針、玻璃棒、三角瓶口等的滅菌。利用電磁波、紫外線、X射線、γ射線或放射性物質(zhì)產(chǎn)生的高能粒子進(jìn)行滅菌，以紫外線最常用。紫外線對芽胞和營養(yǎng)細(xì)胞都能起作用，但細(xì)菌芽胞和霉菌孢子對紫外線的抵抗力強(qiáng)。紫外線的穿透力低，僅適用于表面滅菌和無菌室、培養(yǎng)室等空間的滅菌，對固體物料滅菌不徹底，也不能用于液體物料的滅菌。250～270nm之間殺菌效率高，以波長在260nm左右滅菌效率最高。除紫外線外，X射線和γ射線也可進(jìn)行滅菌。一、滅菌的方法利用飽和蒸汽進(jìn)行滅菌原理：水的沸點(diǎn)隨水蒸氣壓力的增加而上升，高壓情況下可獲得高溫的水蒸汽。借助蒸汽的高溫和蒸汽釋放的潛熱使微生物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、酶和核酸分子內(nèi)部的化學(xué)鍵，特別是氫鍵受到破壞，引起不可逆的變性，使微生物死亡從滅菌效果來看，由于蒸汽有很強(qiáng)的穿透能力，濕熱滅菌對耐熱芽胞桿菌來說，溫度升高10℃時(shí)，滅菌速度常數(shù)可增加8～10倍，對營養(yǎng)細(xì)胞更高。另外蒸汽冷凝為水時(shí)還要釋放出潛熱，因此溫度可進(jìn)一步提高蒸汽來源方便，價(jià)格低廉，滅菌效果可靠濕熱滅菌法是目前最常用的滅菌方法，一般的濕熱滅菌條件為121℃，30min某些化學(xué)藥劑能與微生物發(fā)生反應(yīng)而具有殺菌的作用?；瘜W(xué)藥劑適用于生產(chǎn)車間環(huán)境的滅菌，接種操作前小型器具的滅菌等?；瘜W(xué)藥品的滅菌使用方法，根據(jù)滅菌對象的不同有浸泡、添加、擦拭、噴灑、氣態(tài)熏蒸等。藥劑殺菌原理使用濃度高錳酸鉀使蛋白質(zhì)、氨基酸氧化從而使微生物死亡。0.1～3％漂白粉次氯酸鈉在水溶液中分解為新生態(tài)氧和氯，使細(xì)菌受強(qiáng)烈氧化作用而導(dǎo)致死亡。1～5%酒精溶液使細(xì)胞脫水，引起蛋白質(zhì)凝固變性。對營養(yǎng)細(xì)胞、病毒、霉菌孢子均有殺死作用。75％新潔而滅表面活性劑類潔凈消毒劑，在水溶液中以陽離子形式與菌體表面結(jié)合，引起菌體外膜損傷和蛋白質(zhì)變性。一般用于器具和生產(chǎn)環(huán)境的消毒，不能與合成洗滌劑合用。0.25％甲醛強(qiáng)還原劑，與氨基結(jié)合使蛋白質(zhì)或酶變性。2份37％甲醛溶液＋1份KMnO4；37％甲醛溶液加熱過氧乙酸強(qiáng)氧化劑，廣譜、高效、速效，對營養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌芽胞、真菌孢子和病毒都有殺滅作用。戊二酸在堿性條件下具有殺死芽胞的能力2％酚類如石炭酸（來蘇爾）1～5％二、濕熱滅菌的原理1.微生物的熱阻每一種微生物都有一定的最適生長溫度范圍，當(dāng)微生物處于最低限溫度以下時(shí)，代謝作用幾乎停止而處于休眠狀態(tài)。當(dāng)溫度超過最高限度時(shí)，微生物細(xì)胞中的原生質(zhì)體和酶的基本成分——蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的變化，即凝固變性，使微生物在很短時(shí)間內(nèi)死亡。濕熱滅菌就是根據(jù)微生物的這種特性進(jìn)行的一般無芽胞細(xì)菌，在60℃下經(jīng)過10min即可全部殺死；芽胞細(xì)菌的芽胞在100℃下經(jīng)過幾分鐘至數(shù)小時(shí)才能殺死；某些嗜熱菌能在120℃下耐受20～30min。一般講，滅菌的徹底與否以

能否殺死芽胞細(xì)菌為標(biāo)準(zhǔn)。二、濕熱滅菌的原理致死溫度：殺死微生物的最低溫度。致死時(shí)間：在致死溫度下，殺死全部微生物所需的時(shí)間。在致死溫度以上，溫度愈高，致死時(shí)間愈短。由于一般細(xì)菌、產(chǎn)芽胞細(xì)菌、微生物細(xì)胞和微生物孢子對熱的抵抗力不同，因此，它們的致死溫度和致死時(shí)間也有差別。微生物對熱的抵抗力常用“熱阻”表示熱阻：微生物在某一特定條件下（主要是溫度和加熱方式）下的致死時(shí)間。相對熱阻：某一微生物在某條件下的致死時(shí)間與另一微生物在相同條件下的致死時(shí)間的比值。微生物對濕熱的相對抵抗力微生物大腸桿菌細(xì)菌芽胞霉菌孢子病毒相對抵抗力130000002～101～5二、濕熱滅菌的原理2.微生物的熱死規(guī)律——對數(shù)殘留定律微生物熱死：指微生物受熱失活直到死亡，主要是由于微生物細(xì)胞內(nèi)酶蛋白受熱凝固，喪失活力所致。在微生物受熱失活的過程中，微生物不斷被殺死，活菌數(shù)不斷被減少。微生物熱死速率可以用分子反應(yīng)速率來表示，即微生物活體個(gè)數(shù)減少的速度與任一瞬間殘存的菌數(shù)成正比。dNdt=-kNN——培養(yǎng)基中殘留活菌數(shù)，個(gè)；t——受熱時(shí)間，min；k——反應(yīng)速率常數(shù)，或比死亡速率常數(shù)，min-1。反應(yīng)速率常數(shù)k隨微生物種類和加熱溫度而變化。t=2.303klgN0Nt對數(shù)殘留定律N0——開始滅菌時(shí)原菌數(shù)，個(gè)Nt——經(jīng)時(shí)間t后殘留菌數(shù)，個(gè)。二、濕熱滅菌的原理1/10衰減時(shí)間D：活菌數(shù)在受熱過程中減少到原菌數(shù)的1/10時(shí)所需的時(shí)間。D=2.303k隨時(shí)間的延長，加熱滅菌后的殘存菌數(shù)呈對數(shù)減少，且溫度越高，死亡越快。通常必要的滅菌時(shí)間是110～130℃，5～20min。芽胞對熱耐受力強(qiáng)，為此需要更高的溫度并維持更長的時(shí)間。對細(xì)菌芽胞來說，并不始終符合對數(shù)殘留規(guī)律，特別是在受熱后很短的時(shí)間內(nèi)，培養(yǎng)液中油脂、糖類及一定濃度的蛋白質(zhì)會增加微生物的耐熱性；高濃度鹽類、色素能削減其耐熱性。隨著滅菌條件的加強(qiáng)，培養(yǎng)基成分的熱變性加速，特別是維生素，因此培養(yǎng)液滅菌一般都采用高溫短時(shí)間加熱的方式，這樣可以達(dá)到徹底滅菌和把營養(yǎng)成分的破壞減少到最低限度的目的。滅菌時(shí)間取決于污染的程度（N0）、滅菌的程度（殘留菌數(shù)Nt）和k值。一般考慮產(chǎn)芽胞細(xì)菌和細(xì)菌的芽胞之和作為計(jì)算依據(jù)。在設(shè)計(jì)時(shí)常采用Nt＝0.001（即1000次滅菌中有一次失敗的機(jī)會）。反應(yīng)速率常數(shù)k是微生物耐熱性的一種特征，它隨微生物的種類和滅菌溫度而異。在相同的溫度下，k值愈小，則此微生物愈耐熱。同一種微生物在不同的滅菌溫度下，k值不同，滅菌溫度愈低，k值愈低。某些芽胞細(xì)菌的k值細(xì)菌名稱k值/min-1枯草芽胞桿菌3.8～2.6硬脂嗜熱芽胞桿菌FS15180.77硬脂嗜熱芽胞桿菌FS6172.9產(chǎn)氣梭狀芽胞桿菌PA36791.8在培養(yǎng)基滅菌的過程中，除微生物被殺死外，還伴隨著營養(yǎng)成分的破壞，如糖液焦化變色、蛋白質(zhì)變性、維生素失活、醛基和氨基反應(yīng)、不飽和醛聚合、一些化合物發(fā)生水解等。因此，必須選擇一個(gè)既能達(dá)到滅菌的目的，又能使培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分破壞至最小的滅菌工藝條件。二、濕熱滅菌的原理3.培養(yǎng)基滅菌溫度的選擇反應(yīng)動力學(xué)方程阿倫尼烏斯方程dcdt=-k’ck’=A’e-E/RT反應(yīng)速率常數(shù)與溫度的關(guān)系c——反應(yīng)物濃度，mol/L；t——反應(yīng)時(shí)間，min；k’——化學(xué)反應(yīng)常數(shù)（隨溫度及反應(yīng)類型而變），min-1。A’——頻率因子；E’——反應(yīng)所需的活化能，J/mol；T——絕對溫度，K。雜菌的死亡也屬于一級動力學(xué)方程，與上式類似。一般殺滅微生物營養(yǎng)細(xì)胞的E值約為2.09×105～2.71×105J/mol；殺死微生物芽胞的E值約為4.48×105J/mol；一般酶及維生素等營養(yǎng)成分分解的E值為8.36×103～8.36×104J/mol。由于滅菌時(shí)的活化能E大于培養(yǎng)基營養(yǎng)成分破壞的活化能E’，因此，隨著溫度升高，滅菌速率常數(shù)增加的倍數(shù)>培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分分解的速率常數(shù)的增加倍數(shù)。即當(dāng)滅菌溫度升高時(shí)，微生物殺滅速度提高，超過了培養(yǎng)基營養(yǎng)成分破壞的速度。據(jù)測定，每升高10℃，速率常數(shù)的增加倍數(shù)為Q10。在熱滅菌的過程中，同時(shí)發(fā)生微生物死亡和培養(yǎng)基成分破壞兩個(gè)過程。溫度能加速其過程進(jìn)行的速度，當(dāng)溫度升高時(shí)，微生物死亡的速度更快，因此可以采用較高的溫度，較短的滅菌時(shí)間，以減少培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的破壞，這就是通常所說的“高溫瞬時(shí)滅菌法”。一般化學(xué)反應(yīng)Q10為1.5～2.0；殺滅芽胞的反應(yīng)Q10為5～10；殺滅微生物細(xì)胞的反應(yīng)Q10為35左右。滅菌溫度較高而時(shí)間較短，要比溫度較低時(shí)間較長效果好。對同樣的培養(yǎng)基進(jìn)行126～132℃、5～7min連續(xù)滅菌，其所得培養(yǎng)基質(zhì)量要比采用120℃、30min的實(shí)罐滅菌好，可以得到較高的發(fā)酵水平；對同一類培養(yǎng)基進(jìn)行120℃、20min的實(shí)罐滅菌，其所得培養(yǎng)基的發(fā)酵水平高于120℃、30min的對照，而同樣達(dá)到滅菌的要求。不同滅菌條件下培養(yǎng)基營養(yǎng)成分破壞情況溫度/℃滅菌時(shí)間/min營養(yǎng)成分破壞/%10040099.3110306711515501204271300.581400.0821500.01<1生產(chǎn)實(shí)踐亦說明：高溫滅菌所得培養(yǎng)基的質(zhì)量比較好，并不意味著連續(xù)滅菌比實(shí)罐滅菌好。培養(yǎng)基滅菌方法的選擇，必須從工藝、設(shè)備、操作、成本核算以及培養(yǎng)基的性質(zhì)等具體條件來考慮決定。三、少量培養(yǎng)基的滅菌手提式滅菌鍋結(jié)構(gòu)示意圖手提式立式臺式臥式四、大量培養(yǎng)基的滅菌1.培養(yǎng)基濕熱滅菌方法（1）連續(xù)滅菌連續(xù)滅菌也叫連消，就是將培養(yǎng)基向發(fā)酵罐等培養(yǎng)裝置輸送的同時(shí)進(jìn)行加熱、保溫和冷卻而進(jìn)行滅菌。其溫度一般以126～132℃為宜，總蒸汽壓力要求達(dá)到4.4×104～4.9×104Pa以上。培養(yǎng)基采用連續(xù)滅菌時(shí)，需在培養(yǎng)基進(jìn)入發(fā)酵罐前，直接用蒸汽進(jìn)行空罐滅菌，用無菌空氣保壓，待滅菌培養(yǎng)基流入罐后，再開始冷卻。滅菌時(shí)可采用各種加熱器。培養(yǎng)基的冷卻方式有噴淋冷卻式、真空冷卻式、薄板換熱器式幾種方式。其過程均包括加熱、維持和冷卻連續(xù)滅菌的流程：培養(yǎng)基配料冷卻器加熱塔配料罐無菌培養(yǎng)基四、大量培養(yǎng)基的滅菌1.培養(yǎng)基濕熱滅菌方法（1）連續(xù)滅菌噴淋冷卻優(yōu)點(diǎn)是能一次冷卻到發(fā)酵溫度。真空冷卻只能冷卻到一定溫度，需在發(fā)酵罐中繼續(xù)冷卻，但它可以減少冷卻用水，占地面積少。板式換熱器效率高，且利用冷培養(yǎng)液作冷卻劑，既能冷卻了熱培養(yǎng)基，又預(yù)熱了冷培養(yǎng)液，節(jié)約用水和蒸汽。培養(yǎng)基冷卻方式比較：四、大量培養(yǎng)基的滅菌1.培養(yǎng)基濕熱滅菌方法（1）連續(xù)滅菌連消塔——噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程預(yù)熱至60-70℃132℃40-50℃維持?jǐn)?shù)分鐘連續(xù)滅菌采用連消塔時(shí)，可在20～30s達(dá)到預(yù)定滅菌溫度，由維持罐來保持必需的殺菌時(shí)間。采用噴射殺菌設(shè)備，蒸汽直接噴入生培養(yǎng)液，溫度幾乎立即上升到預(yù)定殺菌溫度，由保溫段管子的長度來保證必要的殺菌時(shí)間。采用板式換熱器，可在20s內(nèi)達(dá)到殺菌溫度，經(jīng)保溫保持必要的殺菌時(shí)間，然后再板式熱交換器另一段20s內(nèi)冷卻到發(fā)酵溫度。四、大量培養(yǎng)基的滅菌1.培養(yǎng)基濕熱滅菌方法（1）連續(xù)滅菌間歇滅菌即實(shí)消，是在每批培養(yǎng)基全部流入發(fā)酵罐后，就在罐內(nèi)通入蒸汽加熱至滅菌溫度，維持一定時(shí)間，將發(fā)酵罐和培養(yǎng)基同時(shí)滅菌，再冷卻到接種溫度備用。其它滅菌設(shè)備一般采用蒸汽滅菌，如設(shè)備十分耐壓，則可采用較高溫度，但必須注意設(shè)備內(nèi)部的凹處及露出的小配管等蒸汽不能到達(dá)的部位。有些設(shè)備也可采用SO2熏蒸滅菌，如葡萄酒發(fā)酵池、罐等。四、大量培養(yǎng)基的滅菌1.培養(yǎng)基濕熱滅菌方法（2）間歇滅菌（分批滅菌）（在夾套中）關(guān)好空氣閥，蒸氣上進(jìn)下出，沖蒸氣，壓力大于2kg/cm2（120℃），最好是4～5kg/cm2（160℃）。當(dāng)罐內(nèi)溫度>80℃，進(jìn)蒸氣口（蒸氣閥）關(guān)掉，出蒸氣口（排氣閥）關(guān)小。打開空氣閥，蒸氣直接進(jìn)罐，121℃，20～30min。從80℃～100℃上升很快，大于100℃后溫度上升很慢，到118℃時(shí)就開始計(jì)時(shí)，到計(jì)時(shí)25min時(shí)立即關(guān)掉蒸氣閥。關(guān)掉蒸氣閥后通入無菌空氣，使罐內(nèi)一直保持正壓（高于大氣壓，空氣不會倒灌入罐內(nèi)）。（在夾套中）立即加自來水冷卻，從下向上，使溫度盡快降到55℃左右，到37～38℃時(shí)關(guān)掉水，也有緩沖性。因?yàn)橛芯彌_性，蒸氣會沖到121℃。在80℃以上沖入蒸氣不容易產(chǎn)生冷凝水，罐內(nèi)體積不會增加很大，培養(yǎng)基不會被稀釋很大。過程：先蒸煮滅菌，但固體培養(yǎng)基呈粒狀、片狀或粉狀，流動性差，不易翻動，吸水加熱易成團(tuán)，冷卻困難。針對這些特點(diǎn)設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)鼓式滅菌機(jī)常用于酒廠、罐等。四、大量培養(yǎng)基的滅菌1.培養(yǎng)基濕熱滅菌方法（3）固體培養(yǎng)基滅菌培養(yǎng)基成分pH值培養(yǎng)基中的顆粒泡沫四、大量培養(yǎng)基的滅菌2.影響培養(yǎng)基滅菌的因素影響培養(yǎng)基滅菌的因素除了所污染雜菌的種類、數(shù)量、滅菌溫度和時(shí)間外，還有其它一些因素：油脂、糖類及一定濃度的蛋白質(zhì)增加微生物的耐熱性，高濃度有機(jī)物會包于細(xì)胞周圍形成一層薄膜，影響熱的傳遞；因此，在固形物含量高的情況下，滅菌溫度可高些。四、大量培養(yǎng)基的滅菌2.影響培養(yǎng)基滅菌的因素（1）培養(yǎng)基成分環(huán)境耐熱性大腸桿菌水60～65℃便死亡10％糖液70℃，4～6min30％糖液70℃，30minpH值對微生物的耐熱性影響很大。pH值6.0～8.0，微生物最耐熱；pH值<6.0，氫離子易滲入微生物細(xì)胞內(nèi)，從而改變細(xì)胞的生理反應(yīng)促使其死亡。所以，pH值愈低，滅菌所需的時(shí)間愈短。四、大量培養(yǎng)基的滅菌2.影響培養(yǎng)基滅菌的因素（2）pH值溫度/℃孢子數(shù)/（個(gè)/ml）滅菌時(shí)間/minpH值6.1pH值5.3pH值5.0pH值4.7pH值4.5120100008753311510000252512131311010000706535302410010000740720180150150培養(yǎng)基中的顆粒小，滅菌容易；顆粒大，滅菌難。一般含有<1mm的顆粒對培養(yǎng)基滅菌影響不大，但顆粒大時(shí)，影響滅菌