腫瘤的基因診斷

腫瘤的分子診斷Molecular

diagnosisoftumors

多基因疾病是指疾病的發(fā)生涉及兩個以上基因的結構或表達調(diào)控的改變。分子診斷是指利用分子生物學和分子遺傳學的方法，通過檢測基因的存在、結構變異和表達的異常，對人類狀態(tài)和疾病做出診斷的方法。

腫瘤的分子診斷是指用分子生物學手段，通過檢測腫瘤相關基因的存在，分析腫瘤相關基因的缺陷、表達及其功能，以達到腫瘤診斷的目的。概念一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制

腫瘤自身原因

外因內(nèi)因無限增殖轉移空間資源

免疫監(jiān)控

攘外

安內(nèi)同流和污視而不見

腫瘤免疫監(jiān)控失活功能喪失一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制1、腫瘤自身一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制1、腫瘤自身LimitlessreplicativepotentialTissueinvasion&metastasisSustainedangiogenesisInsensitivitytoanti-growthsignalsSelf-sufficiencyingrowthsignalsEvadingapoptosis一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制1、腫瘤自身Self-sufficiencyingrowthsignalsAutocrineloopsOver-expressionofreceptorReceptorisalways‘on’Downstreamsignals一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制1、腫瘤自身ExternaltriggersIntracellulartriggersDeathreceptorsCaspasesSensors(8,9)Executioners(3)Evadingapoptosis一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制1、腫瘤自身Insensitivitytoantigrowthsignals一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制1、腫瘤自身SustainedangiogenesisVEGF(血管內(nèi)皮生長因子)FGF1/2（成纖維細胞生長因子）ThrombospondinThalidomideAvastin一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制1、腫瘤自身Tissueinvasionandmetastases一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制1、腫瘤自身LimitlessreproductivepotentialHayflickhypothesisLimitednumberofdoublingsTelomeremaintenanceTelomeraseNotalltumorcellshavethispotentialTumorstemcells

(1)免疫監(jiān)視系統(tǒng)要素

識別力攻擊力組成分工

快速反應特異反應

信息傳遞一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制2、免疫監(jiān)控失調(diào)（1）、免疫監(jiān)視系統(tǒng)識別特異反應抗原遞呈細胞一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制2、免疫監(jiān)控失調(diào)（1）、免疫監(jiān)視系統(tǒng)攻擊效應細胞一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制2、免疫監(jiān)控失調(diào)

（2）、免疫監(jiān)視系統(tǒng)與腫瘤發(fā)生證據(jù)體內(nèi)細胞突變隨時在發(fā)生，但腫瘤不是隨時發(fā)生。免疫缺陷與腫瘤發(fā)生免疫功能與腫瘤發(fā)展一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制2、免疫監(jiān)控失調(diào)（2）、免疫監(jiān)視系統(tǒng)與腫瘤發(fā)生腫瘤監(jiān)控失常原因識別問題腫瘤自身免疫細胞隱蔽抗原來源與正常細胞相同抗原遞呈功能缺失無視一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制2、免疫監(jiān)控失調(diào)（2）、免疫監(jiān)視系統(tǒng)與腫瘤發(fā)生腫瘤監(jiān)控失常原因殺傷問題腫瘤自身

免疫細胞殺傷免疫細胞抑制因子功能異常抑制性免疫細胞一、腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制2、免疫監(jiān)控失調(diào)二、腫瘤的分子診斷內(nèi)容腫瘤標志物的檢測

1978年Herberman在美國國立癌癥研究所召開的人類腫瘤免疫診斷會上提出的。由腫瘤組織和細胞產(chǎn)生的與腫瘤的形成、發(fā)生相關的物質,這些物質存在于腫瘤細胞的胞核、胞質、胞膜上或體液中；不存在于正常成人組織而見于胚胎組織,或在腫瘤組織中含量超過正常含量。存在于腫瘤患者的組織、體液和排泄物中，能夠用免疫學、生物學及化學的方法檢測。

原癌基因癌基因病毒癌基因腫瘤抑制基因腫瘤轉移相關基因腫瘤耐藥基因等腫瘤相關基因細胞基因組中調(diào)控細胞增殖和分化且具有能夠使正常細胞發(fā)生惡性轉化的基因，包括病毒癌基因和細胞癌基因；

癌基因在正常細胞的基因組中存在不表達狀態(tài)表達水平不足以引起細胞的惡性轉化癌基因：定位功能癌基因，產(chǎn)物分泌蛋白生長因子sisPDGFβ鏈跨膜蛋白受體型酪氨酸激酶erbB2,EGF樣受體erbB,EGF受體fms,CSF-1受體膜結合蛋白G-蛋白非受體型酪氨酸激酶rasp21rassrcpp60src胞漿可溶性蛋白非受體型酪氨酸激酶絲氨酸/蘇氨酸激酶信號轉導連接蛋白

Raf，ab1crk,SH2/SH3調(diào)節(jié)蛋白vav,SH2調(diào)節(jié)蛋白胞核蛋白轉錄因子Myb，mycfosjunerbA,T3受體表1細胞癌基因按其產(chǎn)物定位和功能分類能夠抑制細胞惡性轉化或抑制細胞異常增殖的基因

目前研究較多的有p53基因、pRB基因、p16蛋白、p15蛋白、p21等。抑癌基因基因染色體定位相關腫瘤基因產(chǎn)物及功能RB13q14RB、成骨肉瘤、胃癌、SCLC、乳癌、結腸癌p105，控制生長WT11p13WT、橫紋肌肉瘤、肺癌、膀胱癌、乳癌、肝母細胞瘤WT-ZFP，負調(diào)控轉錄因子NF-117p12神經(jīng)纖維瘤、嗜鉻細胞瘤、雪旺氏細胞瘤、神經(jīng)纖維肉瘤GAP，拮抗p21rasBDCC18q21.3結腸瘤P192,細胞粘附分子p5317p13星狀細胞瘤、膠質母細胞瘤、結腸癌、乳癌、成骨肉瘤、SCLC、胃癌、磷狀細胞肺癌P53控制腫瘤生長erbA17q21ANLLT3受體，含鋅指結構的轉錄因表2已確定的幾種抑癌基因野生型P53生物學活性當DNA損傷的時候,P53基因就明顯表達使細胞在G1期生長阻滯，促使細胞凋亡。抑制腫瘤細胞生長保持DNA完整性包括腫瘤轉移促進基因或腫瘤轉移抑制基因。腫瘤轉移相關基因腫瘤耐藥基因其表達使腫瘤細胞對藥物產(chǎn)生耐藥的基因。

血小板衍生生長因子（PDGF）表皮生長因子（EGF）

VGF基因等

腫瘤生長因子

腫瘤的基因診斷腫瘤的基因診斷目前主要集中在以下幾個方面：腫瘤轉移標志物腫瘤抗藥基因突變的癌基因腫瘤相關的病毒基因標志分類機制分子標志應用于癌癥診斷分子遺傳性染色體易位

t(9；22)，t（14；18），t(11；12)等白血病、淋巴瘤等點突變p53,ERras等胃癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、胰腺癌、肺癌等缺失BRCA1，BRCA2，DCC等乳腺癌、結腸癌改變拼接CD44，muc-1,VLA-4等結腸癌、腎癌、乳腺癌、腦瘤等擴增erb-B2,EGFR,N-myc,ras乳腺癌、腦瘤、神經(jīng)母細胞瘤比例改變明膠酶A/TIMP2乳腺癌轉移等病毒性病毒轉化HPV,HCV,HBV，EBV宮頸癌、肝癌、鼻咽癌等組織性組織分化PSA,PSMA前列腺癌muc-18,酪氨酸酸酶，Mage-3黑素瘤AFP,白蛋白肝癌甲狀腺球蛋白甲狀腺癌NPGP9.5，酪氨酸羥化酶表面活性物質等神經(jīng)母細胞瘤腫瘤性腫瘤細胞特征CEA肺癌、結腸癌、胃癌、乳腺癌β-HCG黑素瘤等CK-19肺鱗癌端粒酶結腸癌、乳腺癌、頭頸部癌等微衛(wèi)星體等結腸癌、乳腺癌、頭頸部癌等表3

腫瘤基因診斷的分子標志及其應用

可分為四大類組織特異性基因標志腫瘤特異性基因標志血管生成因子其它與腫瘤轉移相關的分子及基質蛋白酶及其抑制劑腫瘤轉移基因標志物組織特異性基因標志物指腫瘤組織和/或起源正常組織所特有，在淋巴組織和血細胞中不存在的。如角質蛋白家族（CK）mRNA、粘蛋白基因、表皮生長因子受體（EGFR）mRNA等。存在于腫瘤及其起源的正常細胞中，不存在于其他細胞。如CEAmRNA、AFPmRNA、PSAmRNA等血管生成因子如血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）等。

突變的癌基因癌基因的突變是癌基因激活的重要方式和途徑。除了見到較大范圍片段的缺失或插人以及染色體轉位之外，大多數(shù)情況下，都是少數(shù)核苷酸或單個堿基的突變。.癌基因點突變的檢測單鏈構象多態(tài)性（SSCP）檢測技術等

.腫瘤相關的病毒基因EB病毒（EBV）人乳頭瘤病毒（HPV）乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）感染對于這些腫瘤組織細胞中相關病毒基因及其編碼產(chǎn)物的檢測，可以作為這些類型的腫瘤診斷的標志。致瘤病毒引起的惡性轉化作用引起了人們極大的關注腫瘤基因診斷的常用方法PCR、RT-PCRSouthernblot雜交技術、Northernblot雜交技術基因芯片基因測序。腫瘤基因的分子診斷意義

1.腫瘤的早期診斷和篩選2.腫瘤療效監(jiān)測3.腫瘤的預后判斷4.腫瘤微轉移檢測

腫瘤基因檢測在腫瘤微轉移檢測中

應用舉例前列腺癌特異性基因DD3PCA3

DD3PCA3是一種非編碼RNA的基因，定位于9q21～22染色體。它為前列腺癌特異性基因之一，DD3PCA3mRNA僅在前列腺癌細胞中表達，而在其它正常組織和癌組織以及細胞系中均不表達。DD3mRNA14外顯子擴增結果M：50bpDNALadder；1：LNCaP陽性對照；2～3：PCa；4：PIN(前列腺上皮內(nèi)瘤變

)；5～6：BPH(前列腺增生)；7：直腸癌；8：直腸癌癌旁；9：結腸癌；10：結腸癌癌旁；11：乳腺癌；12：甲狀腺癌；13：胃癌；14：胃癌癌旁；15：膀胱癌；16：軟組織纖維肉瘤；17：轉移性腺癌；18：淋巴結轉移性黑色素瘤；19：卵巢成熟性畸胎瘤；20：正常肝臟；21：膽囊；22：胎盤；23：試劑空白。DD3mRNA13外顯子擴增結果M：50bpDNALadder；1：LNCaP陽性對照；2～3：PCa；4：PIN；5～6：BPH；7：直腸癌；8：直腸癌癌旁；9：結腸癌；10：結腸癌癌旁；11：乳腺癌；12：甲狀腺癌；13：胃癌；14：胃癌癌旁；15：膀胱癌；16：軟組織纖維肉瘤；17：轉移性腺癌；18：淋巴結轉移性黑色素瘤；19：卵巢成熟性畸胎瘤；20：正常肝臟；21：膽囊；22：胎盤；23：試劑空白。DD3mRNA34外顯子擴增結果M：50bpDNALadder；1：LNCaP陽性對照；2～3：PCa；4：PIN；5～6：BPH；7：直腸癌；8：直腸癌癌旁；9：結腸癌；10：結腸癌癌旁；11：乳腺癌；12：甲狀腺癌；13：胃癌；14：胃癌癌旁；15：膀胱癌；16：軟組織纖維肉瘤；17：轉移性腺癌；18：淋巴結轉移性黑色素瘤；19：卵巢成熟性畸胎瘤；20：正常肝臟；21：膽囊；22：胎盤；23：試劑空白。前列腺組織和其他腫瘤組織及癌旁組織DD3mRNA檢測結果

M：50bpDNA標準；1：LNCaP陽性對照；2：BPH；3：健康男性志愿者；4～10為PCa；11為試劑空白。

外周血DD3mRNA的RT-PCR擴增電泳圖

RT-PCR檢測結果

44例PCa組中13例可見DD3mRNA陽性結果(其中B期、C期及D期分別有為0例、2例，11例)。30例BPH患者和18名健康男性志愿者標本中均未檢出DD3mRNA。外周血DD3mRNA的巢式RT-PCR擴增電泳圖

M：50bpDNA分子量標準；1：LNCaP陽性對照；2：陰性對照(女性)；3：BPH患者；4：健康男性志愿者；5～8：未治療的PCa；9：試劑空白巢式RT-PCR檢測結果44例PCa組中21例可見DD3mRNA陽性結果(其中B期、C期、D期分別有1例、5例、15例)30例BPH患者和18名健康男性志愿者均未見陽性結果兩種方法對PCa患者外周血DD3mRNA檢出率比較RT-PCR巢式RT-PCR+-+13