甲基化特異性PCR(MSP)原理及引物設(shè)計

MSP原理其基本原理是用亞硫酸氫鈉處理基因組DNA,未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，然后用3對特異性的引物對所測基因的同一核苷酸序列進行擴增。擴增產(chǎn)物用DNA瓊脂糖凝膠電泳，凝膠掃描觀察分析結(jié)果。引物設(shè)計原則標準的PCR引物設(shè)計原則同樣適用于硫化測序PCR(bisulfitesequencingPCR,BSP)除了標準PCR的一些參數(shù)外，“MethPrimer”應(yīng)用3端算法計算自身退火溫度、末端退火溫度、堿基對互補率、GC含量、解鏈溫度(Tm)，而且還提供了上游引物和下游引物的Tm區(qū)別，以及引物中最大允許的單核苷酸重復(fù)率。因為所有非甲基化的“C”都被轉(zhuǎn)換成“T”,所以“MethPrimer”中默認的重復(fù)“T”為8個,而其他堿基重復(fù)數(shù)為5個。DNA的完全硫化是很重要的,因此應(yīng)選擇含盡可能多的非甲基化CpG的“C”區(qū)域作為源序列，設(shè)計引物。對于BSP,引物設(shè)計的原則[1]:①為了區(qū)別甲基化DNA和非甲基化DNA,引物不應(yīng)含有CpG位點;②引物擴增的產(chǎn)物應(yīng)包含盡可能多的CpG位點。對于MSP需要設(shè)計2對引物，一對是針對于經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的甲基化的DNA;另一對是針對于經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的非甲基化的DNA。根據(jù)甲基化的DNA為模板的PCR擴增甲基化的DNA;根據(jù)非甲基化的DNA為模板的PCR擴增非甲基化的DNA。MSP引物設(shè)計的原則:①為了最大限度的區(qū)分甲基化與非甲基化，引物的3’端至少包含1個CpG位點，我們可以自己設(shè)定CpG的“C”距3’末端的最遠距離?！癕ethPrimer”中默認值為3,即是在引物的最后3個堿基中,至少有1個是CpG的“C”。②引物序列中應(yīng)包含盡可能多的CpG位點。③甲基化引物和非甲基化引物序列3’端應(yīng)處于相同的CpG位點。如果，2對引物不在相同的CpG位點退火,PCR結(jié)果就不能準確反映樣本DNA甲基化的情況。但是甲基化引物和非甲基化引物可跨越不同的長度,在起始位點和長度上也可以不同。一般非甲基化引物比甲基化引物長,因為受Tm值限制，由于非甲基化引物中的“C”轉(zhuǎn)化成“T”，導(dǎo)致GC含量降低，從而引起Tm降低。④2套引物應(yīng)有相近的Tm值，“MethPrimer”中默認2套引物Tm值相差不超過5°C，這種限制可使2個PCR反應(yīng)在同一PCR儀中進行。問題解決參考/bbs/topic/91849277keywordsnMSP引物設(shè)計步驟(以CLEC14A基因為例)：找到目標基因的啟動子區(qū)(promoter)序列首先打開ensembl頁面：/index.html如圖在搜索框第一個物種選擇Human，基因填入要研究的基因名，點擊GoCLEC14A Ge門它]EHSGOHWOI7643514.3^254103-3S256369.-1Otypelectintiomaincontaining14A[Sour￡e:HGNCSymbol:Acc:HGNC:19332]O7YPELECTINDOMAINFAMILY14,MEMBERA;CLECUA[*618945]（MIMgenerecord;description:C-TYPELECTINDOMAINFAMILY14,MEMBERA;CLEC^A；!isanexternalreferencematchedLoGenezNSGOUOOQ17E435 生"Varianttable?Phsnoty|DR占■Location■B<ternm.l ?Regulation*Orthologues■Cenetree搜索結(jié)果頁面第一條下面箭頭所指處Regulation，點擊它（這里面主要是基因調(diào)控區(qū)域的信息）打開新的頁面后，下拉至長長的表格，找到第一個promoter，長度在2000bp左右。EFl5R000002Td1i58尺贊」盤on/BuidJCTCFBindingSite143TBB14Q1-3JEB2flflO1324ShOHh田Er^flfl000274ie9Ens-arrUR?fuld.DiyCTCFBindingSite1437593301J75930QO2iaShan'田ENERQQOQM閱7的Eri陽的耐Reau就owBuidePPrarnot&r14擁59JM帖托9SMH19A2Shew田ErjsRunnnaa&rFSiEntBrrHRtpjlMDrvTFhndmgsite-14.3T597660-3T&9BD71670ShowElEbJ￡Rflflfl00274l70GnsarrU氐quhtnrv比也1認CTCFBindingSrt?14-37597G01-37&WOO臥￡h3vElEr.iSR0Q0D00&rrs2曰昨PfejLitecorvTF咖ding創(chuàng)憶143T602660-3TE03519964ShowSBuidg然后點擊最右側(cè)Show旁邊的+,出現(xiàn)的就是啟動子區(qū)的序列了E啥咖E啥咖Pramoteru躬5B4EDL1932Rgyulalary IHuldgAlifaKIfiSZJyjICCTGiirip■:AACTMIiriKil&ZiAIKZIIIGT'a-Lft.iiriiliiLAAlAXOXAIFJJyjETSiXSiidiyaEE&KAAI&LigiLJLHJKnxrjMHCiyS屈匸用]：昭翊UarriTB淚郭Elfcj施AAM跖■::CTTCTsZfCaiAMl&^CrmsiMySKACAi^nTTlCJUUdniAfiJJGICiSmClTTAITW迢仙 咒[旳二苗口翊層:GCmUVTCM迢&宓:WICDNami臨衛(wèi)GIi?3AC&UylAS<3r?KCTD3IGO3rAIWTCCG<3i：TIIC^：aQft.GTrGCrDXAAJCTi：將序列信息復(fù)制，然后就可以進入下一步

MSP引物設(shè)計打開MSP在線引物設(shè)計工具頁面:/methprimer/或者他們新開發(fā)的2.0頁面/methprimer2/進入后我們選擇第一個就好ycutodesignpnmersFormosbisuntAcon^rsionbasedFCRprimersand10predictCpGislandsonaninputsequeficeliadsoallwyoutoseardhifor卩redesignedprimersforhunanandrnaieegenesD^lgnpriiinerton”ourirnpuitseciuerice.PastaanORlGlhlALDhlAseoj^nc^..Input抽QuencodossrftneedwrtuaJbi^urfitaco^Qision(e.g.convert'CtoThT「yths帥nci?顆口沐工aeatrclhforpredesignedprimjersfarhuman^ndlmousegenes:Typeinthebo>:telawgeres^mbaLRefSeqIDtoEsardnfnrpre-deggnedpnmersfarprateincedinggenes.IncRNAs且rdmiRNAs>；egESRI忖站_00皿山曰mir-1-1PANDA)CpGWandprecHicbonrYoucanailsousetheprogramtopredictGpGiglandsinasequence.Pk:k^ELiFibs呂旦口4仃口旳PCIR(RSPjpturrerE那QMKGE皿CC^KO?連茁CCKJ^CJTKCTCTCAiXTCCniC^KIlTiraT^TM匚KrTOZJCrOGJZTGGTTTCATGiZCCrTOZAirTrZAJCJUQTTiXTjIACATOZTCCjUQCCAOHECC匚AXTACAACaiT匚匚AK匚CrGTKGJLAGOIAOGjROGGCCGOGCWCGO；CGGOXGGCiOSCCj&ZTtjUCJZACCTijZA^TCKCOQ^ZGCDXCGmXCOC^Ca：AOOOP^GOG-AJCJWtAACCrCKJWCKCGGWZGOQjPXrGOPZGGOGiSZGGO^ZGGCCCCCXCC0jXGCCfiCraCOP；CGGJZA￡CCCJjZrCCiD5ZCCjlGiZCCGGJDSCOGJ^AjG匚GO：r：i：GOGJKAJWT；AJCOGQS：r(；O：TCrGO；JWGC|iJKrGCfiGrn；AQ：rGAr；TGGJLTinTKCTOjZTrQjKTGmZKCTDZTCCTOZTinODZCATTKrCOGiZCCCJlCAJUjCJl..OGbHClUCCTACMJKgmCETKAJCCTGCJUGGOROOKCCmZiKrOCgH^/ttOGJDZTCOZQZOOOXDGCTTCACOjZTGmxnJUDZCinODZmO^AJTOZTi^ft：CjUUQi：GGGWZCT€ACTrTGTTTGCjJUlfCAG-T'irJlATP；GTTTAJGGCOXG^MOjXCJJUU；JLCGCiUArGCXAjCCt?CGQ；TGrJUlCCQXTTTCCjlAAAAfiWLAJl*fKGiXGGGO：AJGGO?；OGW：GGGCTAJGGQ：TCrGG-fiTOGCWKCTOPZJWCOXXGjULQ；OOCCGCCXCTCJjXrO&；ACjUCTiXGCTTA￡ACjlCCOQrXCATiUCPGjlCCCO&^rOCCTOOHMAGGTACKEOCACCTrOMMQlCG前Pk:k^ELiFibs呂旦口4仃口旳PCIR(RSPjpturrerEMSPpnmersPickMeHiMiahiBSPprimesPickMeHiMiahiBSPprimesPickNestedMSPpnmersPickCCABRApn?rs.<*氣>56<*氣>56E口G]sJkrri匚ediliionfarpnmerselerbnn?WindawShft□bs.!ExpGC%100▼Il?06進入引物設(shè)計頁面后，我們把上一步得到的啟動子區(qū)序列復(fù)制進這個大框框里，然后勾選箭頭標示的兩個選框，沒有其他特殊要求其他部分均按默認選項設(shè)置就好。然后點擊submit。將頁面繼續(xù)下拉即出現(xiàn)設(shè)計好的引物啦PrimerDesignResultsPrirnprri^rnpSeouenoef5'-￡j 打』Lan皿Dme磯伽Gl%Serfm詢fwndTnG伽St曲山忖Ee- MF1GTTGTTGGGAMi^GGIAA'K；20414J33No24MD2C056.450.D7545MPflkMR1CTTAACO&WXTAAAMCGAAA23543521No2m58.G54.69046FTaducIsizePaj「或irtF*Hi『EndColS弓CoEDjirwCamoEndIniTmdiffSCOTE!130414543E5001000572.4133PnEErr^EeSprnenre；5'-J'l/Len泌血DeaeriFfsnipCdCsCsSetfmnvSelf日rdTm Stabihh-UF1GTmTTSQAAGAGGTAA宿TGTT23J14已36Nd242002MSSE