實(shí)驗(yàn)使用測定方法

測定方法1銅離子濃度測定按照GB-437-80進(jìn)行。a：試劑焦磷酸鈉，碘化鉀，冰醋酸，硫代硫酸鈉，可溶性淀粉。b：取1mL樣品，加入49mL蒸餾水。然后加入1g焦磷酸鈉（磨碎），溶解。加入2?4g碘化鉀，加入10mL醋酸，混勻后，置陰暗處靜置10mim。用0.1M硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，滴到淡黃色時(shí)，加入3mL淀粉指示劑，滴至藍(lán)色消失。用99.999%的銅配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液，制作銅離子濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以得到樣品銅離子濃度。2鐵離子濃度測定a試劑：重銘酸鉀溶液1.755g/L，二苯胺磺酸鈉溶液0.2%（W/W）;硫磷酸（濃硫酸：濃磷酸：水=1.5：1.5：7）b滴定：50mL三角瓶中，吸取0.1mL樣品加水稀釋至1mL。然后加入1mL硫磷酸、2?3滴二苯胺磺酸鈉溶液。用重銘酸鉀溶液滴定至亮紫色即到滴定終點(diǎn)。C計(jì)算：每消耗1mL重銘酸鉀溶液，相當(dāng)于0.002g亞鐵離子。亞鐵氧化活性測定亞鐵氧化活性測定方法如下：取菌株的液體培養(yǎng)物，用1/600mol/L的K2Cr2O7對(duì)其中的Fe2+進(jìn)行滴定。每隔一段時(shí)間（一般為3?4h）取0.5mL菌液，用蒸餾水（或1%稀硫酸）稀釋10倍，再取其中的1mL滴定，每進(jìn)行3次重復(fù)，取其中平均值作為滴定值。滴定用1：1的硫酸磷作為絡(luò)合劑，用0.2%二苯胺磺酸鈉作為指示劑，滴定至亮紫色即到滴定終點(diǎn)。5-璜基水楊酸法測定鐵離子濃度的理論基礎(chǔ)是：5-璜基水楊酸和三價(jià)鐵的復(fù)合物在酸性下形成紅色的復(fù)合物；當(dāng)加入氨水后pH升高，5-璜基水楊酸和所有的鐵離子形成黃色的復(fù)合物。三價(jià)鐵的最大吸收波長為：500nm;總鐵的最大吸收波長為：420nm，總鐵的濃度二0.112A（總鐵）。三價(jià)鐵：取0.1mL樣品和3mL10%的5-璜基水楊酸混合，然后加入97mL的去離子水在500nm處測量其吸光值，三價(jià)鐵濃度=0.040A（三價(jià)鐵）?？傝F：在上述溶液中加入3mL25%的氨水然后在425nm處測量其吸光值。制作三價(jià)鐵和總鐵的標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱量硫酸亞鐵和硫酸鐵然后加入去離子水定容，總鐵最終的濃度分別為：1、2、3、4、5、6、7、8、9g/L，然后按照測總鐵的方法測量制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)應(yīng)該大于0.995.三價(jià)鐵的標(biāo)準(zhǔn)曲線如上所示。分光光度計(jì)使用方法：（1）通電儀器自檢 預(yù)熱20min；（2） 用＜MODE＞鍵設(shè)置測試方式：透射比（T），吸光度（A），已知標(biāo)樣濃度方式（CONC）和已知標(biāo)樣濃度斜率（C0）方式；（3） 波長選擇：用波長調(diào)節(jié)旋鈕設(shè)置所需的單色光波長；（4） 放樣順序：打開樣品室蓋，在廣4號(hào)放置比色皿槽中，依次參比液，樣品液1和樣品液2和樣品液3，蓋上樣品室蓋。（5） 參比液校“0”％T，將拉桿抵入最里擋，使光線不能透過參比液，按“0%T”鍵調(diào)0.0； 將參比液拉入光路中，按“100%T”鍵調(diào)100%T，儀器自動(dòng)校正，校正完畢后顯示100后，表示校正完畢，可以進(jìn)行樣品測定。（6）樣品測定：將兩樣品液分別拉入光路中，在“ABS”方式下，則顯示測得的樣品吸光度。掃描電子顯微境觀察離心收集菌體，并用2%的稀硫酸重復(fù)洗滌三次，以去除三價(jià)鐵離子沉淀。然后，取適量菌體涂布在小塊蓋玻片上，自然干燥后，用導(dǎo)電膠布貼于圓形貼片上，噴金，觀察并拍照。3透射電子顯微境觀察按上面的菌體收集方法收集菌體，然后用pH6.0的0.01mol/L乙酸鈉溶液洗滌，取適量菌體滴在載膜銅網(wǎng)上，用PH7.0的2%磷鎢酸染色1min，自然干燥后，在透射電子顯微境下觀察并拍照。4元素硫和細(xì)菌表面的傅里葉紅外（FT-IR）光譜測定在適宜條件下，分別將在不同培養(yǎng)基生長的細(xì)菌經(jīng)Whatman1號(hào)紙過濾去除雜質(zhì)，濾液經(jīng)8,000rpm離心10min，獲得的細(xì)菌重新分散于pH為2的水中，反復(fù)潤洗三次，最后此懸浮液經(jīng)真空冷凍干燥以去除水分。經(jīng)細(xì)菌作用后過濾在濾紙上的硫，重新分散于pH為2的水中，在離心機(jī)中6000rpm離心一分鐘，收集硫沉淀，反復(fù)用pH為2的水沖洗三次（盡量減少細(xì)菌的干擾）后收集和經(jīng)預(yù)處理的硫真空冷凍干燥以去除水分。采用KBr壓片方法，在FT-IR光譜儀（Nexus670,Nicolet,USA）掃描和記錄400?4000cm-1段的紅外吸收光譜值。萬座菌A.manzaensis培養(yǎng)方法：基本培養(yǎng)基：(NH/'SOI1.5g；KHPO0.25g；MgSO-7HO0.25g；4^2 24 4 2CaCl2-2H2O0.01g；酵母提取物0.45g/L；活化：1L基本培養(yǎng)基分別加加35gFeSO4.7H2O，元素硫10g,黃鐵礦30g，黃銅礦30g，在65°下轉(zhuǎn)速180條件下進(jìn)行活化、馴化培養(yǎng)。pyrite(Fe42.25,S48.34,Cu0.32)andchalcopyrite(Cu30.60,Fe22.64,S29.60)andmineralpowdersusedintheexperimentshadasizedistributionof95%passing7412m.疏水性測定：細(xì)胞樣品懸浮在5ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，然后測量600nm處的吸光值；向混合液中加入等體積的正十六烷，振蕩90s，然后靜置30分鐘后測量下層水相的吸光值，（OD"OD水相）/OD初始計(jì)算出疏水性。 成分 初始-(NH4LSO4 水相 初始 KClK2HPO4MgSO4?7H2OCa(NO3)2FeSO4-7H2OpH心-1)30.1 0.5 0.50.0144.72.0動(dòng)電位（Zeta-potential）測定:動(dòng)電位測定用DELSA440SIITypeelectrokineticinstrument進(jìn)行測定。黃銅礦動(dòng)電位測量：黃銅礦粉末濃度為The1g/L，離子強(qiáng)度用NaCl溶液維持為為0.01mol/L。黃銅礦和微生物作用后的動(dòng)電位測量：用磁力攪拌器混合90min，細(xì)胞濃度為1x108cells/mL。細(xì)胞動(dòng)電位測量：2x108cells/mL的細(xì)胞懸浮在0.001mol/L的NaCl中。測量的pH用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)。吸附試驗(yàn)：1g礦粉加到100mL濃度為0.01mol/L的NaCl溶液中，調(diào)節(jié)pH為1.5，微生物的初始濃度為1x108cell/L，用磁力攪拌器混勻90min，然后過濾得到細(xì)胞溶液在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，吸附量二初始細(xì)胞濃度-吸附后的細(xì)胞濃度有關(guān)硫酸根離子測定的具體步驟，包括試劑配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定步驟如下:穩(wěn)定液的配制75g分析純NaCl，溶于300ml水中，加入30ml分析純濃HCl，50ml甘油和100ml95%乙醇，混勻。硫酸根標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制：準(zhǔn)備稱取1.814g無水硫酸鉀（K2SO4分析純，事先在105oC下干燥兩小時(shí)），溶于少量純水后，移入1000ml容量瓶中，用純水定容至刻度。此溶液1.00ml含1.00mg硫酸鹽（SO：-）。硫酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確吸取上述儲(chǔ)備液10.00ml于100ml容量瓶中，用純水稀釋至刻度。此溶液1.00ml含100ug硫酸鹽（SO：-）。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法：稱取0.1gBaCl2晶體若干份備用，向一系列50ml燒杯中準(zhǔn)確加入硫酸根標(biāo)準(zhǔn)使用液，0.00，0.30，0.50，1.00，1.25，1.50，2.00和2.50ml，加蒸餾水至最終體積為5.00ml，然后分別加入穩(wěn)定劑1ml，將配置成標(biāo)準(zhǔn)系列的50ml燒杯逐個(gè)放在磁力攪拌器上，于攪拌中迅速加入0.1gBaCl2品體，計(jì)時(shí)攪拌1min，靜置15min后，用2cm比色皿，在波長420nm處，

蒸餾水做對(duì)照，測得數(shù)據(jù)如下表：表3.2硫酸根標(biāo)準(zhǔn)濃度和相應(yīng)的吸光度SO2-(mg?L-1)吸光度0.00.0096.00.06810.00.11420.00.22830.00.33440.00.4550.00.555比濁法（吸光度）測定：取0.1gBaCl2，穩(wěn)定溶液1ml，吸取待測菌液的上清液250ul，加入50ml燒杯配成50ml體系：搖勻。以蒸餾水空白做對(duì)照，用紫外可見分光光度計(jì)于420nm波長處測定吸光度。計(jì)算：硫酸鹽（mg?L-i）二相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)溶液中硫酸鹽（mg）X1000：水樣體積（ml）菌液中硫酸鹽濃度的變化為：C’二C-C。；式中，C'是菌液中實(shí)際硫酸鹽濃度，C是測得的硫酸鹽的濃度；C0是菌液中硫酸鹽的初始濃度，即剛接入菌種時(shí)，菌液中硫酸鹽的濃度。以硫酸根濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線并作回歸分析如下：0 10 20 30 40 50 60硫酸根濃度(mg/L)圖3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線表3.3作曲線的線性回歸分析ParameterValueErrorA0.00550.002020.011027.17244E-50.01102RSDN P0.99989 0.00325 7 <0.0001由上述對(duì)工作曲線的回歸分析可知：硫酸根濃度在10-50mg-L-1內(nèi)，硫酸根濃度與吸光度呈很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r>0.999,標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.0055+0.011x經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，以每次取菌液250ul所得數(shù)據(jù)可以較好的用詞曲線來求所含硫酸根離子的濃度。5電鏡的鋨酸問題鋨酸(OsO4)――強(qiáng)氧化劑，與氮原子有較強(qiáng)的親和力，對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)成分有良好的固定作用；與不飽和脂肪酸反應(yīng)使脂肪得以固定。(此外還對(duì)脂蛋白、變性的DNA以及核蛋白有固定作用)鋨酸有強(qiáng)烈的電子染色作用，樣品圖像的反差較好。缺點(diǎn)： ①滲透能力較弱(0.1~0.3mm/h)長時(shí)間固定在鋨酸中會(huì)引起一些脂蛋白復(fù)合物的溶解和其他細(xì)胞成分的丟失；組織內(nèi)部出現(xiàn)黑色小顆粒金屬鋨沉淀的人工假；使組織變脆而影響切片。易揮發(fā)，對(duì)皮膚、呼吸道粘膜、角膜有傷害。見光或受熱易氧化，故應(yīng)保存與避光和陰涼處。戊二醛(C5H8O2)――使用廣泛對(duì)糖原、蛋