第12組-激活沉默基因以獲取新型微生物次級代謝產(chǎn)物的策略研究

組員：季宗德郭秋香張羨媛趙琪激活沉默基因以獲取新型微生物次級代謝產(chǎn)物的策略研究1

根據(jù)2007年的統(tǒng)計，1981～2006年間國際上所有批準(zhǔn)的藥物中，超過50%來源于天然產(chǎn)物、天然產(chǎn)物的衍生物或模擬天然產(chǎn)物藥效基團(tuán)的合成化合物。尤其是，目前臨床上使用的60%的抗癌藥物和70%的抗生素是天然產(chǎn)物或者基于天然產(chǎn)物研發(fā)的藥物。

從微生物中發(fā)現(xiàn)和分離新型化合物是發(fā)展新型藥物的主要方向之一.

一直以來，天然產(chǎn)物在人類疾病的治療過程中發(fā)揮著重要作用。2非常值得思考的問題：

隨著大量微生物次級代謝產(chǎn)物的分離,從自然界直接分離具有新結(jié)構(gòu)、新活性化合物變得越來越困難。臨床上病原微生物的耐藥性日益嚴(yán)重，艾滋病、禽流感等新型疾病不斷出現(xiàn)，我們亟需新的研發(fā)策略發(fā)現(xiàn)新型天然藥物。3

隨著基因組測序技術(shù)的飛速發(fā)展和微生物基因組大規(guī)模測序的廣泛開展，目前已測定了超過580個微生物的全基因組序列。中國科學(xué)家更是于2009年發(fā)起了“萬種微生物基因組”計劃，預(yù)計在3年內(nèi)完成1萬種微生物物種全基因組序列圖譜的構(gòu)建。4

在常規(guī)培養(yǎng)條件下，大多數(shù)生物合成基因簇不表達(dá)或以極低水平表達(dá)并在特定條件下被激活而表達(dá)活性產(chǎn)物，這些DNA序列稱為沉默生物合成基因簇。

沉默生物合成基因簇包含了多種結(jié)構(gòu)類型的微生物次級代謝產(chǎn)物編碼信息,提供了豐富的合成生物學(xué)天然元件或模塊,并為未來設(shè)計和構(gòu)建新型微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成途徑提供豐富的物質(zhì)基礎(chǔ)。

因此，如何利用現(xiàn)有的研究成果和技術(shù)手段進(jìn)行激活沉默基因以獲取新型微生物天然產(chǎn)物已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急.5沉默基因簇的異源表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控策略表觀遺傳調(diào)控策略41235核糖體工程策略6宿主細(xì)胞的遺傳修飾改造7單菌多次級代謝產(chǎn)物策略6天然生產(chǎn)菌表達(dá)水平低遺傳操作困難不容易規(guī)模培養(yǎng)

不能應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)生長緩慢沉默基因簇的異源表達(dá)17

所謂基因的異源表達(dá)，就是將整個沉默合成基因簇克隆至質(zhì)粒、黏粒或者細(xì)菌人工染色體上．利用異源宿主對其進(jìn)行表達(dá)，然后利用相關(guān)的分析技術(shù)對含有該克隆的表達(dá)宿主以及對照宿主的發(fā)酵液上清或者提取物進(jìn)行分析，最終對該代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定。8異源表達(dá)使得沉默基因在新的表達(dá)系統(tǒng)中無需按照原來的起始位點(diǎn)進(jìn)行有效轉(zhuǎn)錄，對培養(yǎng)條件也無特殊要求，克服了天然生產(chǎn)菌表達(dá)水平低、遺傳操作困難、不容易規(guī)模培養(yǎng)等缺點(diǎn)，為工業(yè)化生產(chǎn)掃清障礙。另外，它還適用于生長緩慢的微生物，如藍(lán)細(xì)菌、真菌等。由該法已發(fā)現(xiàn)多種新的生物活性物質(zhì)。9良好的異源表達(dá)宿主：鏈霉菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、假單胞菌和黃色粘球菌遺傳途徑的轉(zhuǎn)移功能基因表達(dá)蛋白活性對宿主細(xì)胞的影響實(shí)現(xiàn)天然產(chǎn)物異源表達(dá)生物合成必須要解決以下幾個問題。10正調(diào)節(jié)基因進(jìn)行組成型表達(dá)負(fù)調(diào)節(jié)基因的中斷啟動子的替換轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控策略轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控策略211正調(diào)節(jié)基因進(jìn)行組成型表達(dá)和負(fù)調(diào)節(jié)基因的中斷

沉默基因簇中含有的正調(diào)節(jié)基因和負(fù)調(diào)節(jié)基因，控制次級代謝產(chǎn)物生物合成的開關(guān)。對正調(diào)節(jié)基因進(jìn)行組成型表達(dá)或?qū)ω?fù)調(diào)節(jié)基因進(jìn)行阻斷,可以激活沉默基因簇,獲得微生物新型次級代謝產(chǎn)物。Laureti等對生二素鏈霉菌的不轉(zhuǎn)錄表達(dá)的途徑特異性正調(diào)節(jié)基因samR0484進(jìn)行組成型表達(dá)后，激活了沉默基因簇,最終得到新型天然產(chǎn)物stambomycins，并可能成為抗腫瘤藥物開發(fā)的先導(dǎo)化合物。余貞等中斷變鉛青鏈霉菌的負(fù)調(diào)控基因nsdA，最終合成放線紫紅素。12啟動子的替換將可誘導(dǎo)的啟動子替換原有轉(zhuǎn)錄因子的天然啟動子，轉(zhuǎn)錄不再受原有的微生物控制，同時新的啟動子能夠使轉(zhuǎn)錄因子高水平表達(dá)，反過來又激活整個沉默基因簇的表達(dá)。[14]ChiangYM,SzewczykE,DavidsonAD,etal.Ageneclustercontainingtwofungalpolyketidesynthasesencodesthebiosyntheticpathwayforapolyketide,asperfuranoneinAspergillusnidulans[J].JAmChemSoc.,2009,131(8):2965-2970.在適合于分子遺傳操作的微生物中，許多次級代謝生物合成基因簇含有一個或者多個能夠控制整個基因簇轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)物是立即歸于目標(biāo)基因簇和產(chǎn)量增加的潛能，但不適用于受翻譯后調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子和不包含轉(zhuǎn)錄