細(xì)胞破碎蛋白質(zhì)復(fù)性和固液分離-生物探索課件

第五章細(xì)胞破碎、蛋白質(zhì)復(fù)性和固液分離廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院柯德森第五章細(xì)胞破碎、蛋白質(zhì)復(fù)性和固液分離廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1產(chǎn)物提純過程的不同決定于：對象材料、目標(biāo)產(chǎn)物特性及對其純度的要求；包括兩個基本階段：初級分離階段、純化精制階段。產(chǎn)物提純過程的不同決定于：對象材料、目標(biāo)產(chǎn)物特性及對其純度的2細(xì)胞破碎固液分離初級分離(粗)純化精制下游技術(shù)基本過程細(xì)胞破碎固液分離初級分離(粗)純化精制下游技術(shù)基本過程3初級分離：分離細(xì)胞和培養(yǎng)液，破碎細(xì)胞釋放產(chǎn)物，溶解包含體（包涵體），復(fù)原蛋白質(zhì)，濃縮產(chǎn)物，去除大部分雜質(zhì)等過程。主要決定產(chǎn)物的得率。純化精制：在初級分離的基礎(chǔ)上，用各種高選擇性手段，主要是各種層析技術(shù)，將目標(biāo)產(chǎn)物和干擾雜質(zhì)盡可能地分開，使產(chǎn)物的純度達(dá)到有關(guān)要求。主要決定產(chǎn)物的純度。初級分離：分離細(xì)胞和培養(yǎng)液，破碎細(xì)胞釋放產(chǎn)物，溶解包含體（包4總原則：控制時間、溫度、pH值，減少與空氣接觸的機(jī)會，設(shè)計好各組分的分離順序總原則：控制時間、溫度、pH值，減少與空氣接觸的機(jī)會，設(shè)計好5第二節(jié)細(xì)胞破碎目的：釋放細(xì)胞內(nèi)含物。分類：按照是否存在外加作用力分為機(jī)械法和非機(jī)械法。問題：破碎率是否越高越好？高壓勻漿比珠磨法破碎細(xì)胞的效果好？第二節(jié)細(xì)胞破碎目的：釋放細(xì)胞內(nèi)含物。問題：6破碎方式機(jī)械法非機(jī)械法固體剪切作用液體剪切作用干燥處理溶胞作用珠磨法高壓勻漿壓榨超聲破碎酶溶法化學(xué)法物理法細(xì)胞破碎方法分類圖破碎方式機(jī)械法非機(jī)械法固體剪切作用液體剪切作用干燥處理溶胞作71、高壓勻漿法組成：高壓泵和勻漿閥；作用機(jī)理：高壓泵將電機(jī)的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動轉(zhuǎn)變成勻漿閥柱桿的直線運(yùn)動，從高壓室（幾十兆帕）壓出細(xì)胞懸浮液，經(jīng)過碰撞環(huán)的撞擊后改變方向從出口管噴出，使細(xì)胞經(jīng)歷較高的流速下的剪切碰撞發(fā)生較大的變形，從而達(dá)到破碎細(xì)胞的目的。1、高壓勻漿法組成：高壓泵和勻漿閥；8意大利Niro-Soavi實(shí)驗(yàn)室級高壓均質(zhì)機(jī)意大利Niro-Soavi實(shí)驗(yàn)室級高壓均質(zhì)機(jī)9高壓勻漿閥結(jié)構(gòu)示意圖進(jìn)液口出液口閥座碰撞環(huán)閥桿高壓勻漿閥結(jié)構(gòu)示意圖進(jìn)液口出液口閥座碰撞環(huán)閥桿10高壓勻漿法動力學(xué)方程破碎效率與勻漿閥結(jié)構(gòu)、操作壓力和破碎次數(shù)有關(guān)：Ln(Rm/(Rm-R))=KNPaR：單位生物量釋放出的產(chǎn)物量（mg/G)Rm是R的最大值；K：破碎速率常數(shù)；N：破碎次數(shù)；P：操作壓力；a:與微生物性質(zhì)有關(guān)的指數(shù)系數(shù)。高壓勻漿法動力學(xué)方程破碎效率與勻漿閥結(jié)構(gòu)、操作壓力和破碎次數(shù)11溫控和能耗破碎率-----操作壓力------溫度控制-----能耗溫度對活性物質(zhì)的失活作用；能耗與操作壓力有關(guān)：3.5KW/100MPa能耗也用于溫控：23.8C/100MPa溫控和能耗破碎率-----操作壓力------溫度控制---12存在問題堵塞（不適合團(tuán)塊狀或絲狀真菌），質(zhì)地堅(jiān)硬如包含體易損傷勻漿閥也不適合溫度高易失活，能耗大。存在問題堵塞（不適合團(tuán)塊狀或絲狀真菌），質(zhì)地堅(jiān)硬如包含體易損132、高速珠磨法原理：細(xì)胞和極細(xì)的研磨劑在攪拌槳作用下充分混合，珠子之間及珠子與細(xì)胞之間互相剪切，碰撞，促使細(xì)胞壁破裂，釋放內(nèi)含物。2、高速珠磨法原理：細(xì)胞和極細(xì)的研磨劑在攪拌槳作用下充分混合14幾種常見珠磨器幾種常見珠磨器15常見珠磨器舉例（廣東正本）常見珠磨器舉例（廣東正本）16動力學(xué)方程間歇操作:Ln(Rm/(Rm-R))=Ln(D)=KtD=(1+K1

/J)J連續(xù)操作Ln(Rm/(Rm-R))=KV/f=K`動力學(xué)方程間歇操作:17溫控和能耗采用夾套冷卻的方式實(shí)現(xiàn)溫控,效果較好;能耗與細(xì)胞破碎率成正比;問題：破碎率是否越高越好？高壓勻漿比珠磨法破碎細(xì)胞的效果好？溫控和能耗采用夾套冷卻的方式實(shí)現(xiàn)溫控,效果較好;問題：183、超聲破碎機(jī)理：聲頻高于15~20kHz的超聲波在高強(qiáng)度聲能輸入時可以進(jìn)行細(xì)胞破碎，破碎機(jī)理尚未清楚，可能與空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切力有關(guān)。破碎效率與聲頻、聲能、處理時間、細(xì)胞濃度及菌種類型等因素有關(guān)。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便液量損失少存在問題：使敏感物質(zhì)變性失活，噪聲大，大容量時效率低，應(yīng)用潛力有限。3、超聲破碎機(jī)理：聲頻高于15~20kHz的超聲波在高強(qiáng)度聲19空化現(xiàn)象：在強(qiáng)聲波作用下，引起氣泡形成，脹大和破碎的現(xiàn)象?？栈F(xiàn)象：在強(qiáng)聲波作用下，引起氣泡形成，脹大和破碎的現(xiàn)象。20超聲波破碎儀超聲波破碎儀21大功率

超聲波破碎儀大功率

超聲波破碎儀224、化學(xué)滲透法作用機(jī)理：某些有機(jī)溶劑，抗生素，表面活性劑，金屬螯合劑，變性劑等化學(xué)藥品都可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性，從而使內(nèi)容物有選擇地滲透出來，這種處理方法叫滲透法。問題：EDTA、甲苯、TritonX-100、鹽酸胍和脲的作用機(jī)理？4、化學(xué)滲透法作用機(jī)理：某些有機(jī)溶劑，抗生素，表面活性劑，金23優(yōu)點(diǎn)（相對機(jī)械破碎）：對產(chǎn)物釋出有一定的選擇性；細(xì)胞保持完整，碎片少，利于進(jìn)一步提?。缓怂後尫帕可?，黏度低，便于進(jìn)一步分離。缺陷：時間長，效率低；化學(xué)試劑有毒；通用性差優(yōu)點(diǎn)（相對機(jī)械破碎）：245、酶溶法機(jī)理：就是利用生物酶將細(xì)胞壁和細(xì)胞膜消化溶解的方法。常用的溶酶：溶菌酶(lysozyme)、B-1,3-葡聚糖酶(glucanase)、B-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶（protease)、甘露糖酶(mannanase)、肽鏈內(nèi)切酶（endopeptidase)、殼多糖酶(chitinase)、細(xì)胞壁溶解酶（幾種酶的復(fù)合物）等5、酶溶法機(jī)理：就是利用生物酶將細(xì)胞壁和細(xì)胞膜消化溶解的方法25優(yōu)點(diǎn)：一定的選擇性；細(xì)胞外形完整，核酸釋放少，有利于進(jìn)一步分離過程缺點(diǎn)：（只能用于實(shí)驗(yàn)室）產(chǎn)物抑制造成效率低下；溶酶價格高；通用性差，不易確定最佳條件；優(yōu)點(diǎn)：266、微波加熱法機(jī)理：微波加熱導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)極性物質(zhì)，尤其是水分子吸收微波能，產(chǎn)生大量熱量，使胞內(nèi)溫度迅速上升，液態(tài)水汽化產(chǎn)生的壓力將細(xì)胞膜和細(xì)胞壁沖裂，形成微小孔洞，進(jìn)一步加熱可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部和細(xì)胞壁水分減少，細(xì)胞收縮，表面出現(xiàn)裂紋。6、微波加熱法機(jī)理：微波加熱導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)極性物質(zhì)，尤其是水分子27優(yōu)點(diǎn)：微波穿透性強(qiáng)，選擇性高、加熱效率高。缺陷：一般只適合對熱穩(wěn)定物質(zhì)的分離；被處理的物料要具有良好的吸水性；不適于富含淀粉和樹膠等的天然植物優(yōu)點(diǎn)：微波穿透性強(qiáng)，選擇性高、加熱效率高。28第三節(jié)蛋白質(zhì)復(fù)性包含體（包涵體，inclusionbodies):存在于基因工程細(xì)胞中，主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大部分是克隆表達(dá)的產(chǎn)物，這些產(chǎn)物在一級結(jié)構(gòu)上是正確的，但在立體結(jié)構(gòu)上卻是錯誤的，因此沒有生物學(xué)活性。難溶于水，只有在變性劑溶液中才能溶解。第三節(jié)蛋白質(zhì)復(fù)性包含體（包涵體，inclusionbod29包含體形成原因：（比較復(fù)雜，目前尚不完全清楚。）缺少某些協(xié)助因子（分子伴侶？？）或者由于周圍物理環(huán)境（溫度等）不適，使其難以連續(xù)進(jìn)行次級鍵的形成，中間產(chǎn)物相互凝集而積累形成包含體。問題：是否應(yīng)該設(shè)法減少包含體的形成？如何減少？包含體形成原因：（比較復(fù)雜，目前尚不完全清楚。）30減少包涵體形成的策略1、

降低重組菌的生長溫度，降低培養(yǎng)溫度是減少包涵體形成的最常用的方法，較低的生長溫度降低了無活性聚集體形成的速率和疏水相互作用，從而可減少包涵體的形成[4]。2、

添加可促進(jìn)重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的生長添加劑，培養(yǎng)E.coli時添加高濃度的多醇類、蔗糖或非代謝糖可以阻止分泌到周質(zhì)的蛋白質(zhì)聚集反應(yīng)，在最適濃度范圍內(nèi)添加這些添加劑不會影響細(xì)胞的生長、蛋白質(zhì)的合成或運(yùn)輸，其它促重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的生長添加劑還有乙醇（誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá)）、低分子量的巰基或二硫化合物（影響細(xì)胞周質(zhì)的還原態(tài)，從而影響二硫鍵的形成）和NaCl[5]。3、

供給豐富的培養(yǎng)基，創(chuàng)造最佳培養(yǎng)條件，如供氧、pH等。減少包涵體形成的策略31蛋白質(zhì)的復(fù)性：包含體蛋白質(zhì)溶解于變性劑溶液中，呈變性狀態(tài)，所有的氫鍵、疏水鍵全部被破壞，疏水側(cè)鏈完全暴露，但一級結(jié)構(gòu)和共價鍵不被破壞，當(dāng)除去變性劑后，一部分蛋白質(zhì)可以自動折疊成具有活性的正確構(gòu)型，這一折疊過程稱為蛋白質(zhì)復(fù)性。蛋白質(zhì)的復(fù)性：包含體蛋白質(zhì)溶解于變性劑溶液中，呈變性狀態(tài)，所32包含體的分離及溶解

分離包含體：第一步是對培養(yǎng)收集的細(xì)胞進(jìn)行破碎，比較有效的方法是高壓勻漿結(jié)合溶菌酶處理，然后5000~20000g離心，可使大部分包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離洗滌：包涵體沉淀需用去污劑（TritonX-100或脫氧膽酸鈉）和低濃度變性劑（2mol/L尿素或鹽酸胍等）洗滌除去脂類和膜蛋白，這一步很重要，否則會導(dǎo)致包涵體溶解和復(fù)性的過程中重組蛋白質(zhì)的降解包含體的分離及溶解分離包含體：第一步是對培養(yǎng)收集的細(xì)胞進(jìn)行33溶解：包涵體的溶解必須用很強(qiáng)的變性劑，如8mol/L尿素、6~8mol/L鹽酸胍，通過離子間的相互作用破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果稍差，異氰鹽酸胍最強(qiáng)；去污劑，如SDS，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白，但由于無法徹底去除而不允許用在制藥行業(yè)中；酸，如70%甲酸，可以破壞蛋白的次級鍵從而增溶蛋白，這種方法只適合少數(shù)蛋白質(zhì)。對于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶時應(yīng)加入還原劑（如DTT、GSH、β-ME）打開蛋白質(zhì)中所有二硫鍵，對于沒有二硫鍵的目標(biāo)蛋白有時也應(yīng)使用還原劑，因?yàn)楹蜴I的雜蛋白會影響包涵體的溶解，同時還應(yīng)加入金屬螯合劑，如EDTA或EGTA，用來螯合Cu2+、Fe3+等金屬離子以防止其與還原狀態(tài)的巰基發(fā)生氧化反應(yīng)[10]。要求了解：用于溶解包含體的主要（1）增溶劑（變性劑、去污劑、酸）及其增溶機(jī)理；（2）主要還原劑，為什么加入還原劑；（3）主要金屬螯合劑，為什么要加入。溶解：包涵體的溶解必須用很強(qiáng)的變性劑，如8mol/L尿素、634蛋白質(zhì)的折疊機(jī)理

包涵體蛋白在變性劑作用下，為可溶性伸展態(tài)，在變性劑去除或濃度降低時，就會自發(fā)的從變性的熱不穩(wěn)狀態(tài)向熱力學(xué)穩(wěn)定狀態(tài)轉(zhuǎn)變，形成具有生物活性的天然結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的折疊機(jī)制，目前有多種不同的假設(shè)，但很多學(xué)者認(rèn)為有一個“熔球態(tài)”的中間狀態(tài)，在“熔球態(tài)”中，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)已經(jīng)基本形成，其空間結(jié)構(gòu)也初具規(guī)模，再做一些局部調(diào)整就可形成正確的立體結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)的具體步驟可用下式描述：伸展態(tài)→中間體→后期中間體→天然態(tài)體→聚集體蛋白質(zhì)的折疊機(jī)理包涵體蛋白在變性劑作用下，為可溶性伸展態(tài)，35提高重組蛋白質(zhì)折疊復(fù)性的方法

錯誤發(fā)生的原因：在去除變性劑的同時，重組蛋白質(zhì)在體外折疊，分子間存在大量錯誤折疊和聚合，復(fù)性效率往往很低，包涵體蛋白折疊復(fù)性的效率實(shí)際上取決于正確折疊過程與聚集過程之間的競爭。錯誤發(fā)生的機(jī)制：提高重組蛋白質(zhì)折疊復(fù)性的方法錯誤發(fā)生的原因：在去除變性劑的36在折疊反應(yīng)中，從伸展態(tài)到中間體的速度是非常快的，只需要幾毫秒，但從中間體轉(zhuǎn)變?yōu)樘烊粦B(tài)的過程比較緩慢，是一個限速過程。聚集過程與復(fù)性過程相互競爭，故而應(yīng)盡量避免聚集體的產(chǎn)生。錯誤發(fā)生的機(jī)制①一般認(rèn)為，蛋白質(zhì)在復(fù)性過程中涉及兩種疏水作用，一是分子內(nèi)的疏水相互作用，可促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊；一是部分折疊的肽鏈分子間的疏水相互作用，在復(fù)性過程中，部分折疊的中間體的疏水簇外露，分子間的疏水相互作用會導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集。②蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)雖然由其氨基酸的順序決定，然而伸展肽鏈折疊為天然活性結(jié)構(gòu)的過程還受到周圍環(huán)境的影響，如溫度、pH值、離子強(qiáng)度、復(fù)性時間等因素的影響。在折疊反應(yīng)中，從伸展態(tài)到中間體的速度是非?？斓模恍枰獛缀撩?7不同條件下具體復(fù)性方式1、透析、稀釋和超濾復(fù)性法：這三種方法是最傳統(tǒng)也是應(yīng)用最普遍的蛋白質(zhì)折疊復(fù)性方法，原理都是使變性劑濃度降低到蛋白質(zhì)能恢復(fù)折疊的濃度。缺點(diǎn)：復(fù)性活性回收率低，而且難于與雜蛋白分離。稀釋法大大增加溶液體積，不利于后續(xù)的分離純化；透析法耗時長，易形成無活性蛋白質(zhì)聚集體；超濾法在膜上聚集變性，易造成膜污染；稀釋法處理量太大，不利于工業(yè)放大不同條件下具體復(fù)性方式1、透析、稀釋和超濾復(fù)性法：這三種方法38問題：包含體蛋白質(zhì)含有二個以上二硫鍵應(yīng)該如何處理？為什么要在復(fù)性完成后再加入氧化劑？問題：包含體蛋白質(zhì)含有二個以上二硫鍵應(yīng)該如何處理？為什么要392、高蛋白濃度下的復(fù)性方法：（一個成功的復(fù)性過程在于能夠在高蛋白濃度下仍能得到較高的復(fù)性率。）①一個方法是把變性蛋白緩慢連續(xù)或不連續(xù)地加入到復(fù)性液中。在兩次蛋白加入之間，應(yīng)有足夠的時間間隔使蛋白質(zhì)折疊通過了易聚集的中間體階段。這是由于完全折疊的蛋白通常不會與正在折疊的蛋白一起聚集。②第二種方法是用溫度跳躍策略：變性蛋白在低溫下復(fù)性折疊以減少聚集，直到易聚集的中間體大都轉(zhuǎn)化為不易聚集的后期中間體后，溫度快速升高來促進(jìn)后期中間體快速折疊為蛋白的天然構(gòu)象。③第三種方法是復(fù)性在中等的變性劑濃度下進(jìn)行，變性劑濃度應(yīng)高到足以有效防止聚集，同時又必須低到能夠引發(fā)正確復(fù)性。2、高蛋白濃度下的復(fù)性方法：（一個成功的復(fù)性過程在于能夠在高403、

添加促進(jìn)劑的復(fù)性方法：包涵體蛋白質(zhì)折疊復(fù)性促進(jìn)劑的促進(jìn)作用可以分為：穩(wěn)定正確折疊蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)、改變錯誤折疊蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、增加折疊復(fù)性中間體的溶解性、增加非折疊蛋白質(zhì)的溶解性。3、

添加促進(jìn)劑的復(fù)性方法：包涵體蛋白質(zhì)折疊復(fù)性促進(jìn)劑41通常使用的促進(jìn)劑有：a、共溶劑：如PEG6000~20000，通過與中間體特異的形成非聚集的復(fù)合物，可以阻止蛋白質(zhì)分子間的相互碰撞機(jī)會，減少蛋白質(zhì)的聚集；b、去污劑及表面活性劑：如TritionX-100、CHAPs、磷脂、磺基甜菜堿等對蛋白質(zhì)復(fù)性有促進(jìn)作用，但它們能與蛋白質(zhì)結(jié)合，很難去除；c、氧化-還原劑：對于含有二硫鍵的蛋白，復(fù)性過程中應(yīng)加入氧化還原體系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等，氧化還原系統(tǒng)通過促進(jìn)不正確形成的二硫鍵快速交換反應(yīng)，提高了正確配對的二硫鍵的產(chǎn)率；d、小分子的添加劑：如鹽酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺類等，都可阻止蛋白聚集，它們的作用可能為：穩(wěn)定蛋白的活性狀態(tài)、降低非正確折疊的穩(wěn)定性、增加折疊中間體的穩(wěn)定性、增加解折疊狀態(tài)的穩(wěn)定性。e、0.4~0.6ML-Arg：L-Arg能使得不正確折疊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及不正確連接的二硫鍵變得不穩(wěn)定，使折疊向正確方向進(jìn)行，可大幅度地提高包涵體蛋白質(zhì)的折疊效率。通常使用的促進(jìn)劑有：42通常使用的促進(jìn)劑有：f、添加分子伴侶和折疊酶：分子伴侶是指能夠結(jié)合和穩(wěn)定另外一種蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定構(gòu)象，并能通過有控制的結(jié)合和釋放，促進(jìn)新生多肽鏈的折疊、多聚體的裝配或降解及細(xì)胞器蛋白的跨膜運(yùn)輸?shù)囊活惖鞍踪|(zhì)。折疊酶有二硫鍵異構(gòu)酶、脯氨酸異構(gòu)酶等。分子伴侶和折疊酶都能在體外調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的正確折疊，提高蛋白質(zhì)的合成效率。但這類蛋白在折疊復(fù)性后要除去，而且十分昂貴，因此采用可回收利用的方法如固定化法為好。g、人工伴侶：為模仿分子伴侶而發(fā)展的一種方法：首先，變性蛋白被復(fù)性液中的去污劑捕獲，形成蛋白-去污劑復(fù)合體，復(fù)合體的形成抑制了蛋白的聚集，然后加入環(huán)糊精從復(fù)合體中去除去污劑，使得蛋白質(zhì)正確折疊。h、單克隆抗體：待折疊復(fù)性的蛋白質(zhì)的抗體可有效協(xié)助復(fù)性，但只限于此蛋白才能獲得明顯的助折疊作用。I其它：多聚離子化合物如肝素可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的復(fù)性，具有穩(wěn)定天然蛋白質(zhì)的作用；甘油可以增加黏度，減少分子碰撞的機(jī)會，減少錯配以提高復(fù)性效率；適量的鹽濃度可以降低某些帶電基團(tuán)間的斥力，有利于蛋白質(zhì)的折疊；輔助因子、短鏈醇、高滲物等能有效的降低聚集體的形成，對蛋白有穩(wěn)定的作用。通常使用的促進(jìn)劑有：434、

液相色譜（LC）復(fù)性法：疏水相互作用色譜（HIC）、離子交換色譜（IEC）、凝膠排阻色譜（SEC）、親和色譜（AFC）已成功的對變性蛋白進(jìn)行了復(fù)性。4種色譜法，SEC的分離效果是LC中最差的，鹽酸胍會在IEC柱上保留，與蛋白一起洗脫下來，AFC使用范圍窄、所需時間長、價格昂貴，HIC是其中較為理想的。變性蛋白在HIC上的復(fù)性機(jī)理為：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)、變性劑和雜蛋白進(jìn)入HIC系統(tǒng)后，由于變性劑在柱子上的作用力較弱，變性蛋白質(zhì)的作用力較強(qiáng)，變性劑首先同變性的蛋白質(zhì)分離，隨流動相一起流出色譜柱，又因HIC固定相能提供較常法高出十至數(shù)百倍的能量*，在變性蛋白質(zhì)被HIC固定相吸附的同時瞬時除去以水合狀態(tài)附著在蛋白質(zhì)表面和與固定相表面接觸區(qū)域的小分子*，而蛋白質(zhì)的特定的疏水性氨基酸殘基與HIC固定相表面作用以形成區(qū)域立體結(jié)構(gòu)，接著形成折疊中間體，隨著流動相的不斷變化，變性蛋白質(zhì)不斷地在固定相表面上進(jìn)行吸附-解吸附-再吸附，并在此過程中逐漸被復(fù)性，形成與天然蛋白質(zhì)構(gòu)象相同的蛋白質(zhì)，并流出色譜柱。HIC固定相是從高鹽溶液中吸附變性蛋白質(zhì)，且與變性劑瞬時分離，不僅大大降低了蛋白質(zhì)間的聚集作用，還因固定相在分子水平上為變性蛋白提供里很高的能量，使水化的變性蛋白質(zhì)瞬時失水，并形成局部結(jié)構(gòu)以利于蛋白質(zhì)從疏水核開始折疊。HIC在蛋白質(zhì)復(fù)性的同時還能與其它雜蛋白進(jìn)行很好的分離，且HIC柱便宜、快速，故有很好的發(fā)展?jié)摿Α?、

液相色譜（LC）復(fù)性法：疏水相互作用色譜（HIC44與傳統(tǒng)的稀釋法和透析法相比，液相色譜復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)是：在進(jìn)樣后可很快的除去變性劑；色譜固定相對變性蛋白質(zhì)的吸附可明顯的減少、甚至完全消除變性蛋白質(zhì)分子在脫離變性劑環(huán)境后的分子聚集，從而避免了沉淀的產(chǎn)生，提高蛋白質(zhì)復(fù)性的質(zhì)量和活性回收率；在蛋白質(zhì)復(fù)性的同時，可使目標(biāo)蛋白質(zhì)與雜蛋白分離達(dá)到純化的目的，使復(fù)性和純化同時進(jìn)行；便于回收變性劑，降低廢水處理成本。與傳統(tǒng)的稀釋法和透析法相比，液相色譜復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)是：455、反膠束復(fù)性法：由于蛋白質(zhì)在反膠束內(nèi)水相中可以保持其構(gòu)象和活性，運(yùn)用相轉(zhuǎn)移技術(shù)可以將蛋白質(zhì)分子包于反膠束內(nèi)，由于這樣可使蛋白質(zhì)相互分離，減少了蛋白質(zhì)折疊過程中的聚集作用，通過逐漸降低變性劑的濃度和加入氧化-還原劑，可使變性蛋白質(zhì)復(fù)性，但表面活性劑對蛋白質(zhì)具有變性作用。5、反膠束復(fù)性法：由于蛋白質(zhì)在反膠束內(nèi)水相中可以保持其構(gòu)象和46第四節(jié)固液分離分離細(xì)胞、細(xì)胞碎片、包含體、沉淀物等的手段，不僅應(yīng)用于初級階段，而且也應(yīng)用于精制階段。第四節(jié)固液分離分離細(xì)胞、細(xì)胞碎片、包含體、沉淀物等的手段，47一、離心沉降根據(jù)固體和液體之間的密度差,利用離心機(jī)提供的離心力實(shí)現(xiàn)固液分離的手段.是實(shí)現(xiàn)固液分離的主要手段;優(yōu)點(diǎn)：技術(shù)易掌握；結(jié)果重復(fù)性好沉降的難易取決于固體物質(zhì)和液體的密度差,同時還取決于固體和液體的其他性質(zhì)以及離心機(jī)的離心能力.(可以顆粒沉降速度表示)一、離心沉降根據(jù)固體和液體之間的密度差,利用離心機(jī)提供的離心48斯托克斯公式(Stokes):Uc=d2(ρs-ρL)rω2/18μUc顆粒沉降速度;d顆粒直徑(假定為球形)ρs是固體密度ρL是液體密度r離心半徑;ω角速度;(rω2:離心力)μ粘度斯托克斯公式(Stokes):49(rω2:離心力):是固液分離最重要的影響因素;分離因數(shù):a=(rω2:離心力)/ga是衡量離心力的大小主要指標(biāo),應(yīng)該主要是增大角速度而不是直徑;提高離心效果可通過增加轉(zhuǎn)速和延長時間來取得；(rω2:離心力):是固液分離最重要的影響因素;50轉(zhuǎn)筒常規(guī)工業(yè)用離心機(jī)

（--張家港華大離心機(jī)公司）SSC型離心機(jī)為三足式上部人工卸料沉降離心機(jī)，該系列離心機(jī)裝鼓壁上無孔，屬沉降型轉(zhuǎn)鼓，操作維修方便。主要使用于固相顆粒細(xì)小，懸浮液粘性較大，過濾介質(zhì)再生困難，且含量較少的懸浮液的固液分離。。

轉(zhuǎn)筒常規(guī)工業(yè)用離心機(jī)

（--張家港華大離心機(jī)公司）SSC型離51管式工業(yè)用離心機(jī)

（--張家港華大離心機(jī)公司）懸浮液從進(jìn)料管進(jìn)入轉(zhuǎn)鼓，固相顆粒在離心力場作用下受到離心力的加速沉降至轉(zhuǎn)鼓內(nèi)壁，沉降的顆粒在螺旋輸送器葉片的推動下，從（直筒段）沉降區(qū)通過（錐段）干燥區(qū)至固相出口排出；經(jīng)澄清的液相從溢流孔溢出。從而實(shí)現(xiàn)固、液相自動、連續(xù)的分離?？蓱?yīng)用于脫水、濃縮、分級澄清等不同場合。

管式工業(yè)用離心機(jī)

（--張家港華大離心機(jī)公司）懸浮液從進(jìn)料管52刮刀卸料工業(yè)用離心機(jī)

（--張家港華大離心機(jī)公司）主電機(jī)帶動套裝的內(nèi)外轉(zhuǎn)鼓全速旋轉(zhuǎn)，物料由進(jìn)料管引入轉(zhuǎn)鼓，在離心力作用下，液相物穿過濾布和內(nèi)轉(zhuǎn)鼓壁濾孔排出內(nèi)轉(zhuǎn)鼓，匯集到內(nèi)外轉(zhuǎn)鼓間的間隙內(nèi)，穿過到虹吸室的通孔進(jìn)入虹吸室，再由虹吸裝置抽走排出機(jī)外。固相物截留在內(nèi)轉(zhuǎn)鼓形成環(huán)形濾餅層。進(jìn)料達(dá)到預(yù)定容積后停止進(jìn)料，進(jìn)一步分離，此時可進(jìn)行洗滌。洗滌、分離結(jié)束，刮刀自動旋轉(zhuǎn)，將固相物刮下經(jīng)輸料螺旋排出機(jī)外，然后自動洗網(wǎng)，開始下一個循環(huán)。刮刀卸料工業(yè)用離心機(jī)

（--張家港華大離心機(jī)公司）主電機(jī)帶動53二、微孔膜過濾根據(jù)流體各組分尺寸大小的不同，利用高分子聚合膜，過濾分離微米級的細(xì)胞、細(xì)胞碎片和生物大分子的過程，叫微孔膜過濾。目前主要有三種膜過濾方式：微孔過濾：超濾：反滲透：切割分子量?微孔膜超濾膜反滲透膜二、微孔膜過濾根據(jù)流體各組分尺寸大小的不同，利用高分子聚合膜54優(yōu)點(diǎn)：容易做到封閉式操作，不受環(huán)境污染設(shè)備投資少，操作安全；加工量可大可小，十分方便；有利于分離密度差小而難以離心的固體，可直接用于下游的層析過程。缺點(diǎn)：技術(shù)難以掌握，影響因素多；穩(wěn)定性和重復(fù)性不好；膜堵塞問題是最難以解決的問題優(yōu)點(diǎn)：55微濾技術(shù)要點(diǎn)：選擇合適的膜：①不與蛋白質(zhì)、脂類等發(fā)生吸附；②選擇合適的孔徑；③無機(jī)陶瓷膜的選擇及其優(yōu)點(diǎn)選擇合適的操作條件：達(dá)西公式：V=ΔP/[μ(Rc+Rm)]問題：從達(dá)西公式分析操作條件的選擇，維持Rc(濾餅阻力)方式？微濾技術(shù)要點(diǎn)：選擇合適的膜：①不與蛋白質(zhì)、脂類等發(fā)生吸附；②56無機(jī)陶瓷膜的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：（機(jī)械強(qiáng)度大、惰性更大）孔徑均勻，過濾效果好；耐蒸氣消毒、耐酸堿和有機(jī)溶劑；堅(jiān)固耐用，使用壽命長；可以加壓反向沖洗缺點(diǎn)：造價高；過濾面積小；表現(xiàn)對蛋白質(zhì)一定的吸附；無機(jī)陶瓷膜的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：（機(jī)械強(qiáng)度大、惰性更大）57各種微孔膜柱及設(shè)備各種微孔膜柱及設(shè)備58各種微孔膜柱及設(shè)備各種微孔膜柱及設(shè)備59操作方式切向流過濾（錯流過濾、交叉流過濾、十字過濾）：就是一種維持恒壓下高過濾速度的技術(shù)，其原理就是：使懸浮液在過濾介質(zhì)表面作切向流動，利用液體的剪切作用將介質(zhì)表面的固體移走，當(dāng)移走固體與固體沉積速率相同時，過濾速度就保持恒定，控制不同的切向流速度就可以得到不同的過濾速度。（實(shí)際是維持了Ｒc).目前幾乎所有的膜固液分離都采用切向流方式操作方式切向流過濾（錯流過濾、交叉流過濾、十字過濾）：60細(xì)胞破碎蛋白質(zhì)復(fù)性和固液分離-生物探索課件61細(xì)胞破碎蛋白質(zhì)復(fù)性和固液分離-生物探索課件62細(xì)胞破碎蛋白質(zhì)復(fù)性和固液分離-生物探索課件63切向流過濾的缺點(diǎn)產(chǎn)生的剪切力使蛋白質(zhì)產(chǎn)物失活，流速越快，失活越嚴(yán)重；能耗比較高；不能避免膜的污染和堵塞，當(dāng)膜的阻力增大時，無法防止過濾速度的下降；切向流過濾的缺點(diǎn)產(chǎn)生的剪切力使蛋白質(zhì)產(chǎn)物失活，流速越快，失活64２、脈沖反洗切向流過濾原理：在切向流過濾中間歇地在膜的背面加一反壓，迫使部分濾液反透過膜以沖掉膜上的固體沉積和膜孔中的堵塞物，使過濾速度保持在比較高的水平。２、脈沖反洗切向流過濾原理：在切向流過濾中間歇地在膜的背面加65細(xì)胞破碎蛋白質(zhì)復(fù)性和固液分離-生物探索課件66３、調(diào)整生化懸浮液的性質(zhì)調(diào)整pH值和離子強(qiáng)度；加入絮凝劑；加入過濾助劑（硅藻土系列）３、調(diào)整生化懸浮液的性質(zhì)調(diào)整pH值和