第五講-其它工具酶課件

其它工具酶

2014-9-29其它工具酶

2014-9-29一、逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）是一種有效的轉(zhuǎn)錄RNA成為DNA的酶，又稱RNA依賴的DNA聚合酶，其產(chǎn)物DNA稱cDNA，即互補(bǔ)DNA。逆轉(zhuǎn)錄酶也是一個(gè)多功能酶一、逆轉(zhuǎn)錄酶1、RNA依賴的DNA聚合酶以RNA鏈為模板，以帶有3’-OH末端的DNA片段為引物，沿5’

3’方向合成DNA鏈。幾乎所有真核生物的mRNA分子3’末端都有一段PolyA，故加入寡聚dT后，mRNA就可以成為逆轉(zhuǎn)錄酶很好的模板，由此可合成cDNA。1、RNA依賴的DNA聚合酶2、外切RNA酶活性底物是RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，其水解方向有兩種：從RNA鏈5’末端外切：稱5’

3’外切RNA酶從RNA鏈3’末端外切：稱3’

5’外切RNA酶2、外切RNA酶活性3、DNA依賴的DNA聚合酶以ssDNA為模板，以帶有3’-OH末端的DNA片段為引物，沿5’

3’方向合成DNA鏈。可在新合成的DNA鏈上合成另一條互補(bǔ)DNA。

3、DNA依賴的DNA聚合酶

4、逆轉(zhuǎn)錄酶在基因工程中的應(yīng)用①合成cDNA，克隆至載體中；②黏性末端補(bǔ)平、標(biāo)記；③雙脫氧測(cè)序時(shí)，如用其它酶效果不好，可使用反轉(zhuǎn)錄酶。4、逆轉(zhuǎn)錄酶在基因工程中的應(yīng)用①合成cDNA，克隆至載體中；5、商品化的逆轉(zhuǎn)錄酶禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）逆轉(zhuǎn)錄酶Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV）逆轉(zhuǎn)錄酶兩種逆轉(zhuǎn)錄酶均無3’

5’外切DNA酶活性，故不具備校對(duì)功能，在高濃度dNTP和Mn2+存在下，容易出現(xiàn)核苷酸錯(cuò)誤摻入。5、商品化的逆轉(zhuǎn)錄酶二、甲基化酶（Methylase）(一)甲基化酶的種類與識(shí)別序列(二)甲基化對(duì)限制酶切的影響二、甲基化酶（Methylase）(一)甲基化酶的種類與識(shí)原核生物甲基化酶是作為限制與修飾系統(tǒng)中的一員，用于保護(hù)宿主DNA不被相應(yīng)的限制酶所切割。1.

限制修飾系統(tǒng)I、II、III型中的甲基化酶三個(gè)系統(tǒng)中的甲基化酶可使細(xì)菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤發(fā)生甲基化，形成5-甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤。在DNA重組實(shí)驗(yàn)中，常用的甲基化酶屬于II型，它與相應(yīng)的限制酶的識(shí)別順序相同，其甲基化位點(diǎn)與限制酶位點(diǎn)可同可不同。M.EcoRI

GA

mATTCC

EcoRI

GAATTC

不同

M．HpaI

C

mCGG

HpaI

CCGG

相同原核生物甲基化酶是作為限制與修飾系統(tǒng)中的一員，用于保護(hù)宿主2.E.coli

的dam、dcm甲基化酶這類甲基化酶與限制酶無關(guān)，不構(gòu)成相應(yīng)的限制修飾系統(tǒng)。Dam甲基化酶可在GATC

序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基。

GmATCDcm甲基化酶識(shí)別CCAGG或CCTGG序列，在第二個(gè)胞嘧啶C5位置上引入甲基。

CmCAGGCmCTGG2.E.coli的dam、dcm甲基化酶這類甲基化酶與限該酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反應(yīng)與DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄等過程有關(guān)。3.哺乳動(dòng)物的甲基化酶該酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反應(yīng)與DNA復(fù)制、基因E.coli中至少有3種依賴于甲基化的限制系統(tǒng)

mcrA、mcrBC和mrr

它們識(shí)別的序列各不相同，但只識(shí)別經(jīng)過甲基化的序列都降解由CpG甲基化酶（MSssⅠ）作用的DNA。4.E.coli中依賴于甲基化的限制修飾系統(tǒng)E.coli中至少有3種依賴于甲基化的限制系統(tǒng)mcr(一）甲基化酶的種類與識(shí)別序列(二）甲基化對(duì)限制酶切的影響(一）甲基化酶的種類與識(shí)別序列1、修飾酶切位點(diǎn)M.TaqⅠ處理DNA后，GTCGAC將不受HincⅡ切割。GTCGACGTCAACGTTGACGTTAACHincⅡM.TaqⅠ

TCGA1、修飾酶切位點(diǎn)M.TaqⅠ處理DNA后，GTCGA2、產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)DpnⅠ是依賴甲基化的限制酶TCGATCGA受M.TaqⅠ處理后形成甲基化產(chǎn)物TCG*ATCG*A

，其中G*ATC

即為DpnⅠ位點(diǎn)。2、產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)DpnⅠ是依賴甲基化的限制酶三、核酸酶SI1.作用特點(diǎn)：此酶是從米曲霉（Aspergillusoryzae）中提取的，可降解ssDNA或RNA，又稱單鏈特異性酶，其降解產(chǎn)物是5’-磷酸末端的單或寡核苷酸片段。核酸酶SI對(duì)DNA底物的活性比對(duì)RNA強(qiáng)。高濃度的核酸酶SI可從缺口（nick）或裂口（gap）處降解dsDNA。三、核酸酶SI1.作用特點(diǎn)：核酸酶SI對(duì)DNA底物的活性比2.作用條件：需要Zn2+作為輔助因子，最適pH是4.5這是與基因工程的其它工具酶不同的兩個(gè)特點(diǎn)。3.在基因工程中的應(yīng)用：由于核酸酶SI能從DNA片段中切除單鏈尾巴，因而在質(zhì)粒的重建和DNA重組中被廣泛使用。切除單鏈粘性末端，產(chǎn)生平末端，再用T4連接酶連接。切除cDNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。2.作用條件：1.作用特點(diǎn)：此酶是從小牛腺中提取的，可催化單核苷酸轉(zhuǎn)移到另一個(gè)DNA分子的3’-OH末端上，不需要模板，其引物是帶3’-OH末端的ssDNA（Mg2+為輔因子）。平末端的dsDNA或帶有3’延伸末端的dsDNA，只有CO2+存在時(shí)才能作引物。四、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶1.作用特點(diǎn)：四、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶2.在基因工程中的應(yīng)用：在連接平末端DNA片段時(shí)加上互補(bǔ)的同源多聚物（同聚物加尾法）

2.在基因工程中的應(yīng)用：

五、外核酸酶III1.作用特點(diǎn)：此酶是從E.coli中分離得到的，是一種從dsDNA的3’-OH末端降解產(chǎn)生5’單核苷酸的外切酶。2.在基因工程中的應(yīng)用：產(chǎn)生具有5’延伸末端的DNA片段制備特異的DNA探針五、外核酸酶III1.作用特點(diǎn)：作用特點(diǎn)此酶是從乳白短桿菌（Brevibaceriumaldidum）中提取的。能以漸進(jìn)的方式從線型DNA分子的3’，5’兩端同時(shí)降解，產(chǎn)物是單核苷酸或寡核苷酸片段：形成截短了的平端雙鏈DNA分子（約占10-20%）以及帶有約5個(gè)核苷酸突出單鏈的截短分子（約占80-90%）。作用對(duì)象：可以是帶粘末端或是平末端的dsDNA，對(duì)3’，5’兩端的結(jié)晶速度相同。六、外核酸酶Bal31作用特點(diǎn)六、外核酸酶Bal312.作用條件：降解時(shí)需要Ca2+作輔助因子，以EDTA作螯合劑，可使Bal31失活3.在基因工程中的應(yīng)用：可用于組建DNA的物理圖譜，以及造成克隆DNA分子的末端缺失2.作用條件：1.作用特點(diǎn)：此酶是從噬菌體T4感染的E.coli中分離的能催化ATP的γ-磷酸轉(zhuǎn)移到DNA或RNA的5’-OH末端上七、T4多核苷酸激酶1.作用特點(diǎn)：七、T4多核苷酸激酶2.在基因工程中的應(yīng)用：可用于缺乏5’-磷酸的待連接DNA片段的5’端磷酸化：反轉(zhuǎn)錄mRNA生成的cDNA、人工合成的DNA片段及PCR擴(kuò)增得到的DNA都缺少5’-磷酸基，在與克隆載體連接之前，需用T4多核苷酸激酶將DNA的5’-磷酸化。2.在基因工程中的應(yīng)用：1.作用特點(diǎn)：從細(xì)菌中分離的堿性磷酸化酶簡(jiǎn)稱BAP從小牛腸中分離的簡(jiǎn)稱CAP。它能特異性地切去DNA或RNA的5’-磷酸。底物可以是ssDNA、dsDNA或RNA，也可以是核糖或脫氧核糖核苷三磷酸。八、

堿性磷酸化酶1.作用特點(diǎn)：八、堿性磷酸化酶2.在基因工程中的應(yīng)用：在用32P標(biāo)記DNA的5’末端之前，除去未標(biāo)記的磷酸。在DNA重組技術(shù)中，除去DNA片段的5’-磷酸，阻止質(zhì)粒自身環(huán)化，提高轉(zhuǎn)化效率。2.在基因工程中的應(yīng)用：第五講-其它工具酶課件形成帶有兩個(gè)缺口的開環(huán)分子，由于環(huán)狀DNA（即使是有缺口的環(huán)狀DNA）的轉(zhuǎn)化效率比線狀質(zhì)粒DNA片段高得多，因此絕大多數(shù)轉(zhuǎn)化子都含有重組質(zhì)粒，并且這樣的缺口在寄主細(xì)胞內(nèi)可自行補(bǔ)上。形成帶有兩個(gè)缺口的開環(huán)分子，由于環(huán)狀DNA（即使是有缺口的環(huán)九、依賴于DNA的RNA聚合酶1、來源：SP6噬菌體RNA聚合酶——來源于感染鼠傷寒沙門氏菌LT2菌株

T4或T7噬菌體RNA聚合酶——來源于噬菌體感染的大腸桿菌九、依賴于DNA的RNA聚合酶1、來源：SP6噬RNA聚合酶實(shí)際上就是轉(zhuǎn)錄中的RNA合成酶，識(shí)別DNA中各自特異的啟動(dòng)子序列，并沿此dsDNA模板起始RNA的合成。無需引物，但需識(shí)別特異性位點(diǎn)。2、活性：①體外合成RNA分子。②用于表達(dá)外源基因。3、用途：RNA聚合酶實(shí)際上就是轉(zhuǎn)錄中的RNA合成酶，識(shí)別DNRNaseA來源于牛胰，為內(nèi)切核酸酶，可特異攻擊RNA上嘧啶殘基的3’端?？沙NA:RNA中未雜交的RNA區(qū)，可用來確定DNA或RNA中單堿基突變的位置。廣泛用來去除DNA樣品中的RNA。十、核糖核酸酶A（RNaseA）RNaseA來源于牛胰，為內(nèi)切核酸酶，可特異攻擊RNADNaseⅠ來源于牛胰，是內(nèi)切核酸酶，可優(yōu)先從嘧啶核苷酸的位置水解雙鏈或單鏈DNA。DNaseⅠ用途廣泛，如切口平移標(biāo)記時(shí)在dsDNA上隨機(jī)產(chǎn)生切口；在閉環(huán)DNA上引入單切口，以將分子截短；建立隨機(jī)缺失的嵌套缺失體，用于功能分析或測(cè)序；除去RNA樣品中的DNA。十一、脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）DNaseⅠ來源于牛胰，是內(nèi)切核酸