大腸桿菌的耐熱腸毒素s的分子生物學(xué)研究進(jìn)展

大腸桿菌的耐熱腸毒素s的分子生物學(xué)研究進(jìn)展

腸毒素性結(jié)腸炎（etec）是導(dǎo)致幼牛腹瀉的主要病原體。etec有兩個原因：一個是腸毒素，另一個是粘液素（或定位因素）。已知的結(jié)合包括k88、k99、菲菲、987p和其他粘土。etec通過這些粘土物質(zhì)在主要腸道粘膜上的上皮細(xì)胞中產(chǎn)生大量的水分，導(dǎo)致大量的腸毒素。ETEC產(chǎn)生兩種腸毒素:一種為不耐熱性腸毒素(LT),它由一個分子量為28kD的A亞單位結(jié)合5個分子量為11.5kD的B亞單位組成,全LT或B亞單位具有良好的免疫原性;另一種為耐熱性腸毒素(ST),成熟的ST為18或19個氨基酸組成的小肽,有很強(qiáng)的毒素活性,而免疫原性極差.Rebertson綜合研究的資料表明,20%~30%的ETEC為LT+/ST-;30%~40%的ETEC為LT+/ST+;而ST-/ST+接近50%.由于ETEC產(chǎn)生的ST在ETEC性腹瀉中扮演重要角色,對人類和家畜健康有很大威脅,因此從分子水平研究ST的各種性質(zhì)、致病機(jī)理和免疫原性等,對控制由ST引起的腹瀉性疾病具有重要意義.1一般生物學(xué)特征1.1引起乳鼠和乳豬腸水腫根據(jù)ST的生物學(xué)特性及致病性,將其分為STⅠ(又稱STa)和STⅡ(又稱STb)兩類.STⅠ可溶于甲醇,可引起乳鼠和乳豬腸積水;STⅡ不溶于甲醇,對乳鼠不引起腸積水,而對斷乳小豬可致腸積水.STⅠ可根據(jù)它的來源不同及核苷酸序列的差異分為STⅠa與STⅠb,STⅠa為牛源或豬源(又稱STp),STⅠb為人源(又稱STh),STⅡ則為豬源性.1.2抗各種蛋白酶水解不同來源的STⅠ其理化性質(zhì)相同.STⅠ分子呈中酸性,疏水性氨基酸比例高,在低離子強(qiáng)度時易與堿性疏水性多肽聚合.STⅠ分子量較小,為2000D左右,也有報道為4000D和5000D.18肽的小分子具有3個鏈內(nèi)二硫鍵,因該鍵屬于共價鍵,鍵能高,不易破壞,故分子結(jié)構(gòu)高度穩(wěn)定,因而耐熱(在100℃?30min和121℃?15min不失活)、耐酸堿(在pH=2~10穩(wěn)定)、耐多種有機(jī)溶劑和表面活性劑;抗各種蛋白酶水解,為肽類毒素中最特殊者;不被淀粉酶、胰蛋白酶、脂酶、鏈霉蛋白酶、糖化酶等失活.但STⅠ對可破壞二硫鍵的氧化劑和還原劑高度敏感,0.1mol/L的2-巰基乙醇、4×10-5?mol/L的二硫蘇糖醇和過甲酸均可使其失活.可溶于甲醇、丙酮等有機(jī)溶劑.經(jīng)等電聚焦測定,ST的等電點為4.3左右.ST純化后為白色粉末,其最大吸收波長為275nm,最小吸收波長為255nm.STⅠ單獨不具免疫原性,但與大分子偶聯(lián)可產(chǎn)生免疫原性.J.C.Frantz將人工合成的STa連接到載體蛋白上,加上福氏佐劑免疫動物(母豬、母牛)后可產(chǎn)生抗體,且抗體高峰能維持?jǐn)?shù)周,使出生的新生動物對產(chǎn)腸毒性大腸桿菌的攻擊有保護(hù)作用.1.3st的檢測對STⅠ的檢測廣泛應(yīng)用的是乳鼠試驗,即先將過液培養(yǎng)物(或離心后的上清液)經(jīng)口灌入2日至4日齡的乳鼠,4h后剖腹取出全部腸管稱重,計算腸管與剩余尸體重量的比率,此法簡單易行,重復(fù)性較好.對STⅡ的檢測是用斷乳小豬腸環(huán)結(jié)扎試驗,即將4~9周齡斷乳小豬麻醉,取其腸段扎成6cm腸環(huán),每環(huán)注入5mL菌液或上清液,然后計算腸環(huán)中液體與腸段長度的比率(mL/cm).檢測ST的免疫學(xué)反應(yīng)主要有放射免疫測定法(RIA)和ELISA等.隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,近年來建立了ST基因探針檢測方法,應(yīng)用結(jié)果表明,敏感性和準(zhǔn)確性俱佳.1.4小鼠細(xì)胞花生四烯酸業(yè)已證實,STⅠ能激活顆粒性鳥苷酸環(huán)化酶(GC),而二硫化合物能抑制此酶,從而使STⅠ無作用.STⅠ的生物活性具有組織特異性,可使回腸上皮細(xì)胞內(nèi)cGMP(環(huán)磷酸鳥苷)增高10倍而結(jié)腸下段僅增高1.8倍,對其他組織、器官無活性,此特異性可能與受體分布有關(guān).Mg2+,Mn2+等可增強(qiáng)STⅠ的作用.STⅠ的激活作用具有專一性,這是由于STⅠ對小腸粘膜顆粒性酶比可溶性酶具有更高的親和力,同時小腸粘膜本身以顆粒性酶為主.有關(guān)STⅠ激活酶的作用機(jī)理主要有兩種學(xué)說:一是“瀑布”學(xué)說,認(rèn)為STⅠ結(jié)合到細(xì)胞膜表面,打開鈣離子能道,鈣攝取增加,激活調(diào)鈣蛋白,觸發(fā)磷酸酯酶A2,膜磷脂釋放花生四烯酸,后者的過氧化物及過氧化氫代謝物使GC激活,但有的學(xué)者認(rèn)為,STⅠ并不引起小腸細(xì)胞花生四烯酸的釋放及改變膜脂成分;二是“直接偶聯(lián)”學(xué)說,該學(xué)說認(rèn)為STⅠ激活GC是直接的,不需要介導(dǎo)酶,即與已知腺苷酸環(huán)化酶激活機(jī)理相似,依靠ST受體復(fù)合物系統(tǒng)激活.近來,S.A.Waldman研究發(fā)現(xiàn)了小腸粘膜顆粒性GC與ST受體偶聯(lián)的新模式,即兩者可能通過細(xì)胞骨架成分緊密相連.這種偶聯(lián)可抵抗各種離子、非離子去垢劑、鹽及尿素等的溶解,而其他組織上的酶可被上述物質(zhì)所溶解,但ST受體抵抗溶解作用,說明其他組織中酶與受體無特殊偶聯(lián)關(guān)系.S.A.Waldman觀察到GC只有與細(xì)胞骨架成分、ST受體結(jié)合在一起才被STⅠ所激活.ST受體及GC定位于細(xì)胞膜刷狀緣的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中,其中含有豐富的細(xì)胞骨架成分,包括肌纖蛋白等不受去垢劑溶解的物質(zhì),這些骨架成分提供基質(zhì)使GC定位于此,并與受體偶聯(lián).有趣的是小腸粘膜細(xì)胞膜上的cGMP依賴性蛋白激酶也與受體及GC位于相同位置,并與骨架成分緊密相連.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),位于刷狀緣的25kD蛋白磷酸化后,在小腸可介導(dǎo)STⅠ毒素誘導(dǎo)的離子轉(zhuǎn)移.據(jù)以上資料推測,STⅠ引起水和電解質(zhì)分泌是由刷狀緣上STⅠ受體,GC,cGMP依賴性蛋白激酶,25kD底物蛋白形成一個功能性復(fù)合物所介導(dǎo),這些成分可以共價鍵形式緊密連接于細(xì)胞骨架成分上,并保持一種有利于各種成分相互作用的適當(dāng)?shù)目臻g排列結(jié)構(gòu),從而發(fā)揮各自的功能.上皮細(xì)胞cGMP增多而引起腸液潴留致瀉已予公認(rèn),但對其中的機(jī)理尚不明了.業(yè)已發(fā)現(xiàn),cGMP和cAMP一樣,能使電泳性質(zhì)相似的刷狀緣膜和basolateral膜蛋白磷酸化,小腸絨毛上皮細(xì)胞內(nèi)cGMP含量增高,Cl-主動吸收受抑制,跨膜電位和短環(huán)路電流增加,8-溴cGMP模擬的短環(huán)路電流增加約為8-溴cAMP的1/3,推測ST的作用可能與霍亂腸毒素通過cAMP升高使Na泵磷酸化、Na+吸收障礙導(dǎo)致水瀉的機(jī)理相似,即cGMP使Cl-轉(zhuǎn)運蛋白磷酸化,Cl-主動轉(zhuǎn)運受抑制,進(jìn)而腸腔內(nèi)電解質(zhì)與水潴留引起腹瀉.2對st的生物研究2.1基因型ssr-t1653.編碼ST的基因位于產(chǎn)腸毒素性質(zhì)粒(Ent)上.含有STⅠ基因的質(zhì)粒多是接合性質(zhì)粒,分子量為46~97MD,與編碼性菌毛的F質(zhì)粒有一定的同源性.含有STⅡ基因的質(zhì)粒分子量為21~80MD,至少一部分質(zhì)粒是接合性質(zhì)粒.STⅠ常與定居因子在同一大質(zhì)粒上,STⅡ常與LT在同一大質(zhì)粒上.某些ST基因位于轉(zhuǎn)座子上,兩端有反向重復(fù)序列,稱為Tn1681.2.2重組質(zhì)粒pslm003的構(gòu)建M.H.W.So等首先報道成功地克隆了ST基因,即將帶有ST毒性決定簇的牛源大腸桿菌ESF0041的質(zhì)粒用EcoR?Ⅰ切出8.9kb的片段,然后與載體pSC101連接,轉(zhuǎn)化到非產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌,使ST的產(chǎn)量大約增加3倍,然后又將這一雜種質(zhì)粒進(jìn)行亞克隆,用BamHⅠ酶切產(chǎn)生2個片段,大小分別為5.6kb和3.4kb,再分別與pBR322重組,轉(zhuǎn)化后進(jìn)行篩選檢測,發(fā)現(xiàn)只有3.4kb片段產(chǎn)生ST.以此再用Pst?Ⅰ消化產(chǎn)生1.7kb,1.4kb和0.3kb片段,將1.7kb片段再克隆后可產(chǎn)生ST,命名此克隆為pMS3.后來作者又對pMS3進(jìn)行了亞克隆,用Taq?Ⅰ與Hind?Ⅰ酶切,連接轉(zhuǎn)化后得到了TC1,并確定TC1就是質(zhì)粒ESF0041含STⅠ基因的最小DNA片段,大小約473bp.S.L.Moseley等用人源ETEC的Ent質(zhì)粒,經(jīng)BamHⅠ酶切,把1.9kb的片段克隆到pBR322中,得到重組菌株pSLM003,把pSLM003經(jīng)Taq?Ⅰ酶切的840bp片段再克隆到pBR322上,構(gòu)建出高產(chǎn)毒株pSLM004.ST在致病過程中起著非常重要的作用,幾乎所有重癥腹瀉患者的樣本中,只要分離到ETEC,大都產(chǎn)生ST.如何增強(qiáng)ST的免疫原性,是當(dāng)前大腸桿菌腸毒素研究的熱門課題之一.L.M.Guzman-Verduzco等用EcoRIt和Hpa?Ⅱ酶切pRIT10250質(zhì)粒,加入linker后,重組到pUC13上,構(gòu)建出重組質(zhì)粒pGK26,再對pGK26進(jìn)行Hind?Ⅲ和Sst?Ⅰ雙酶切后,作為載體分子,把編碼LTB的基因片段連在ST下游上,構(gòu)建出重組質(zhì)粒pGSK51.J.D.Clements把編碼ST的基因片段連在LTB基因的下游,構(gòu)建出3種不同的ST-LTB融合基因.ELISA檢測表明,當(dāng)LTB基因和ST結(jié)構(gòu)基因之間插入一段7個氨基酸(Asp-Pro-Arg-Val-Pro-Ser-Ser)的linker時,ST的表達(dá)水平最高;當(dāng)兩者之間有3個氨基酸(Ile-Pro-Gly)時,ST表達(dá)次之;當(dāng)兩者之間不插入氨基酸時,ELISA沒有檢測到ST的存在.張兆山等采用不耐熱腸毒素LTB亞單位基因作為載體分子,將編碼ST抗原決定簇的寡核苷酸連接在消除了終止密碼子的LTB基因下游,并使之處于同一開放閱讀框架中,構(gòu)建了3種不同的ST-LTB融合基因.核苷酸序列分析證實該融合基因有正確的閱讀框架;ELISA檢測表明,這些融合基因既能表達(dá)LTB,也能表達(dá)ST.當(dāng)LTB基因和ST結(jié)構(gòu)基因之間插入21bp的寡核苷酸時,ST的表達(dá)水平最高,比野生菌株高8倍以上;當(dāng)兩者之間插入9bp的linker時,ST表達(dá)次之,是E.coliH10407菌株的3倍左右;二者相隔33bp時,ST的表達(dá)水平與野生菌株相近.Westrnblotting試驗顯示了ST-LTB融合蛋白的存在,但該融合蛋白依然還具有ST毒性.許崇波等將ST前體蛋白基因(pro-STⅠ)與β-半乳糖苷酶基因融合在一起,結(jié)果表達(dá)的融合蛋白具有良好的免疫原性,且失去了STⅠ本身的生物學(xué)毒性.王玉炯等將pro-STⅠ基因融合在產(chǎn)氣莢膜梭菌β-毒素基因的下游,其表達(dá)產(chǎn)物具有2種抗原的免疫原性,免疫動物后產(chǎn)生了具有中和活性的抗體,且已失去STⅠ本身的生物學(xué)毒性.目前已用該基因工程菌株制備出雙價基因工程滅活苗,在市場上應(yīng)用效果良好,取得了良好的社會和經(jīng)濟(jì)效益.R.M.Lawrence等用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切pUC9STb質(zhì)粒,用Klenow片段補(bǔ)平末端,再用BamH?Ⅰ酶切,然后重組到pKC30上,構(gòu)建出重組質(zhì)粒pKC30STb,這使STb的產(chǎn)量比其他野生菌株高10~20倍.R.Urban等把編碼phoA的基因片段重組到編碼STb的質(zhì)粒pT7-ST73上,構(gòu)建成pST-phoA融合基因,其產(chǎn)生的融合蛋白分子量為50000D,具有類似STb的生物學(xué)活性,為進(jìn)一步研究STb提供了很好的材料.2.3編碼sta基因產(chǎn)物和stb的核苷酸序列及生物活性對STⅠa,STⅠb,STⅡ不同基因的DNA序列分析有助于闡明ETEC的ST群結(jié)構(gòu).STⅠa和STⅠb的基因有70%的DNA序列同源,其基因產(chǎn)物C端的18個氨基酸序列是高度保守的,其他序列有68%的氨基酸同源.STⅡ類的毒素基因編碼成一條有71個氨基酸的多肽,核苷酸序列不同于STⅠ基因,這為STⅡ毒素組成一個不同類群提供了依據(jù).從ETEC培養(yǎng)的上清液中已分離出具有ST活性、含18個氨基酸的肽鏈.對純化的STⅠ肽鏈作序列分析,表明它是由STⅠ基因的54~72密碼子進(jìn)行編碼.在STⅠa和STⅠb之間,ST肽鏈18個氨基酸的序列十分恒定.A.M.K.Saeed等報道了從牛中分離的E.coli?M490,B41,M524產(chǎn)生的ST具有完全相同的氨基酸順序.這些結(jié)果表明了編碼STⅠ的基因是高度保守的,廣泛分布于不同寄主來源的大腸桿菌中.M.So等將編碼STⅠ的轉(zhuǎn)座子樣片段Tn1681進(jìn)行亞克隆和插入突變,正確確定了STⅠ基因在該轉(zhuǎn)座子中的位置,測定了Tn1681中心部分的全部核苷酸序列,從中可以看到這一基因具有在細(xì)菌中單獨表達(dá)所必需的全部特征:-10序列的同源性,16S核糖體結(jié)合位點,轉(zhuǎn)譯開始、終止信號,轉(zhuǎn)錄停止信號.由此核苷酸序列推算出該基因產(chǎn)物是72個氨基酸,氨基端前18個氨基酸多數(shù)是親水的,表明這一區(qū)域的多肽起STⅠ毒素信號序列的作用.該氨基酸序列的另一個特征是半胱氨酸占有很大比例(18%),它們可能形成3對二硫鍵,使STⅠ具有非常緊密的構(gòu)象,從而解釋了STⅠ對熱、對酸的穩(wěn)定性及對氧化劑和還原劑的敏感性.R.A.Houghten等通過測定人工合成的線型STⅠ分子中二硫鍵形成的先后順序,間接測定了3對二硫鍵的位置,分別為5-10,6-14及9-17.經(jīng)氧化劑或還原劑處理,ST的生物活性消失,表明二硫鍵對于ST的生物活性是必需的.S.L.Moseley等以從孟加拉國腹瀉病人分離到的產(chǎn)ST菌株153837-2為出發(fā)菌株,構(gòu)建了含STⅠb的基因工程菌株pSLM003和pSLM004,然后用Maxam,Gilbert和Sanger方法對STⅠb進(jìn)行核苷酸序列分析,并與STⅠa作比較.發(fā)現(xiàn)在72個密碼的216個核苷酸中有76個不同,序列差異31%,這一差異產(chǎn)生29個氨基酸的變化,其中多數(shù)(16/29)改變是非保守的.STⅠa與STⅠb盡管有這些差異,但它們在結(jié)構(gòu)上仍有很大的相似性.對STⅠa基因產(chǎn)物的分析表明,起始部分的蛋白質(zhì)是用于轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)移的,STⅠa的核苷酸序列分析支持這一解釋.前18個氨基酸有13個是親水的,這一部分與轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)移蛋白的其他信號肽有關(guān);而STⅠb基因產(chǎn)物前19個氨基酸有13個是親水的,并且半胱氨酸的數(shù)量和位置相同.STⅠa與STⅠb基因產(chǎn)物有7個氨基酸位置相同,表明這兩種分子都可以發(fā)生相同的分子間關(guān)系,產(chǎn)生相同的二級結(jié)構(gòu).此外,這兩種基因之間大部分同源性在密碼53~68之間,表明這一區(qū)域在分子功能方面起決定性作用.馮書章等對STⅠb進(jìn)行了亞克隆和核苷酸序列分析,結(jié)果顯示pBST2-6重組質(zhì)粒中STⅠb基因序列第133位與S.L.Moseley等報道的序列出現(xiàn)了T-A置換,使STⅠb基因的編碼氨基酸由Cys向Ser變化.2.4pcr檢測etec的方法:單片酸和多核苷酸探針t4S.L.Moseley等首次用基因探針對臨床腹瀉分離的大腸桿菌檢測ETEC,這是基因探針首次用于臨床細(xì)菌學(xué)診斷.研究者用pRITI0036質(zhì)粒的157bp?HinfⅠ-STⅠp片段和pSLM質(zhì)粒215bp?HpaⅡ-STⅠh片段以32P標(biāo)記作為STⅠ基因探針,用菌落原位雜交法檢測了產(chǎn)生STⅠ的ETEC.近幾年國內(nèi)外對STⅠ的探針檢測大多源于該法,并用它對臨床腹瀉糞便、水源和食品中的ETEC污染情況進(jìn)行了大量分子流行病學(xué)調(diào)查.其他用于STⅠ檢測的探針還有Hanna等使用的PNG10質(zhì)粒的510bp?EcoR?Ⅰ-STⅠh探針,該探針不與STⅠp雜交.以上的基因片段ST探針,特異性高,但制備時需經(jīng)多次酶切和PAGE分離,故難于大量制備探針.馮書章對pSLM004質(zhì)粒進(jìn)行TaqⅠ一次酶切,2%瓊脂糖凝膠電泳分離,收集其840bp的TaqⅠ-STⅠ片段,缺口翻譯法(NT)標(biāo)以32P后作為探針,對不同來源的大腸桿菌進(jìn)行檢測,陽性結(jié)果與乳鼠試驗符合率為70%.P.Echeverria等采用從質(zhì)粒pCHL6的460bp?HindⅢ-HinfⅠ片段制備探針對豬源ETEC進(jìn)行了STⅡ檢測,結(jié)果表明,該探針不與STⅠ探針雜交.雖然隨著PCR技術(shù)的應(yīng)用,大量小片段基因探針的獲得已不再是難題,但是標(biāo)記酶切片段制備探針,易受載體質(zhì)粒DNA的污染,有時會出現(xiàn)雜交陽性而乳鼠試驗陰性的假陽性結(jié)果,因此需要進(jìn)一步提高探針的特異性.而人工合成的片段更短的寡核苷酸探針,其特異性可以檢出單個堿基的錯配.在已知編碼ST基因的基礎(chǔ)上,人們合成22~32個左右的ST寡核苷酸,利用隨機(jī)引物法、T4多核苷酸激酶法以及缺口翻譯法標(biāo)記,以標(biāo)記物作為寡核苷酸探針,其特異性和敏感性都不亞于克隆基因片段制備的探針.2.5st結(jié)構(gòu)中的cysSTⅠ在菌體內(nèi)首先合成72個氨基酸的前體,STⅠ前體由1~19氨基酸前區(qū)、20~54氨基酸后區(qū)和55~72氨基酸成熟STⅠ區(qū)組成.前區(qū)為STⅠ類保守的領(lǐng)頭肽,在STⅠmRNA翻譯開始時便為信號肽酶所切割;后區(qū)在STⅠ通過內(nèi)膜進(jìn)入細(xì)胞間質(zhì)過程中有重要作用.要成為成熟STⅠ,轉(zhuǎn)運后的后區(qū)STⅠ必須經(jīng)過加工和在分子內(nèi)形成正確的二硫鍵.成熟的大腸桿菌STⅠ為18~19氨基酸的多肽,與其他腸桿菌ST一樣,STⅠ含有13個高度保守的氨基酸序列(5~17氨基酸),這段氨基酸小肽保留了STⅠ的完全毒性,為一毒性區(qū),具有與天然毒素相似的受體蛋白結(jié)合能力.保守區(qū)內(nèi)的6個Cys組成Cys5-Cys10,Cys6-Cys14和Cys9-Cys173個分子內(nèi)二硫鍵,其中Cys6-Cys14組成的二硫鍵與STⅠ毒性有關(guān)而最為重要,其他2個二硫鍵在維持分子結(jié)構(gòu)上起作用,從而使STⅠ成為完整的結(jié)構(gòu).用人工合成的全毒性STⅠ類似物Mpr5-STⅠp(Mprβ-巰基丙酸)的晶體X射線衍射分析STⅠ的三維結(jié)構(gòu),從N端Mpr5-Cys17的C端,3個β-轉(zhuǎn)角右手螺旋結(jié)構(gòu)通過整個分子組合而成3個轉(zhuǎn)角,位于沿由Cys5-Cys9,Asnll-Cys14,Cys14-Cys17組成的螺旋構(gòu)成的V形結(jié)構(gòu)處,并且通過3個二硫鍵將它們緊密連接,其中第二個轉(zhuǎn)角與STⅠ毒性關(guān)系最大.所有組成氨基酸的側(cè)鏈都面向分子的外面,說明STⅠ具有疏水特性,Asn11-Ala13側(cè)鏈形成一個特殊的突起凸出分子表面.除Cys7/Glu7,Ala15和Gly16外,所有NH基團(tuán)都包埋在分子內(nèi),與分子內(nèi)或轉(zhuǎn)角內(nèi)氫鍵有關(guān).總體來說,整個細(xì)胞表面為一親水脂特性,第二轉(zhuǎn)角區(qū)的疏水特性Pro12-Ala13側(cè)鏈可能作用