石蠟切片實驗指導

組織石蠟切片技術（編寫者：艾鵬飛）原理：以石蠟作為包埋劑，用旋（回）轉切片機切成薄片，經(jīng)脫水、染色、再脫水、通明、封片等處理制成永存切片，便于在顯微鏡下觀察組織、細胞內的顯微形態(tài)和結構。藥品與試劑：福爾馬林、二甲苯、石蠟、乙醇（50％、70％、80％、95％、100%）、蒸餾水、合成樹脂、鮮蛋白、純甘油、麝香草酚、冰醋酸、硫酸鋁鉀、碘酸鈉、伊紅 Y、蘇木精。儀器及設備：恒溫水浴箱、金屬包埋框（或玻璃平皿、硬紙折疊小盒等）、酒精燈、毛筆鉛筆、小刀、持蠟器、擦布、切片刀、切片機、載玻片、蓋玻片、玻璃棒、滴管、燒杯、無菌手術器械（包括眼科剪刀、眼科鑷子、小脂肪夾）、2毫升注射器、顯微鏡、接物測微計、接目測微計。1、取材：組織塊長1.0厘米，寬0.5厘米，厚0.5厘米，注明樣本（根尖、葉片、花藥、子房等）名稱、編號。如用種子萌發(fā)的根尖，在根長至1-2厘米時，切取靠近根尖端部根莖約0.5厘米。2、固定：用FAA固定液（5%福爾馬林+5%冰醋酸+90%的70%酒精）固定24h。3、沖洗：用70%酒精換洗3次，每次1-2h。4、脫水：80%、90%乙醇1—2h,再分別用無水乙醇（A）、（B）各脫水1—2h。5、透明：無水乙醇：二甲苯(1：1)透明1—2h,二甲苯(A)、(B)各透明1—2h。6、 透蠟：買來的新蠟需經(jīng)過煮煉方可使用，方法是：加溫至 60C熔化，待凝固后再熔化，反復加溫多次以除去石蠟內的水分，增加石蠟的密度，最后經(jīng)過濾后使用。依次用1：1、1：2二甲苯石蠟各浸泡15—20min(55。,再分別用石蠟(A)、(B)各浸泡20—30min(60C)。此過程在恒溫水浴箱中進行。7、 包埋：包埋，即將浸透石蠟的組織塊鑄成蠟塊的過程。目的是增加組織的硬度，以便制成微薄的切片，其過程如下：(1)將所用器械，包括金屬包埋框(或是玻璃平皿，硬紙折疊小盒等)，包埋用解剖鑷等放入熔蠟箱內，烘熱待用。(2)將酒精燈點燃，從熔蠟箱中取出包埋框，于包埋框及其底板(通常用金屬板或玻璃板)上涂一層液狀石蠟或甘油，然后將熔化了的石蠟小心注入包埋器內。(3)用熱鑷子取出滲透石蠟的組織塊，平置于包埋器內，注意將所需要的切面向上，平貼于包埋器的底部。(4)將組織埋妥后及時將標本標記緊貼于所包組織的蠟塊邊緣，以免混亂。標記可用鉛筆、毛筆書寫，千萬不可用鋼筆或圓珠筆。(5)當于室溫下包埋器表層的石蠟凝固后，將包埋器平穩(wěn)拿起，放入冷水中，以便包埋蠟塊快速冷卻凝固。注意一定要等表層石蠟凝固后再放，否則水浸入蠟塊內，使蠟塊內出現(xiàn)水泡，致包埋失敗。(6)包埋好的蠟塊應進行修整，從包埋框取出蠟塊，用小刀依照組織大小，切去邊緣余蠟。注意蠟塊四邊均要平切，組織周圍留下適度蠟邊，底部平切，使成平整方塊，其高度不宜超過1厘米，切忌損傷組織塊。(7)包埋好的蠟塊應呈均勻的半透明狀，若蠟塊中組織出現(xiàn)混濁，則可能是由于組織脫水、透明不充分所致。若蠟塊中出現(xiàn)白色冰花樣結晶，則可能是由于包埋動作太慢，放入組織塊時石蠟已出現(xiàn)部分凝固，或是包埋用石蠟中含有過多的二甲苯，還可能是冷卻用水溫度高，石蠟包埋完好后不能快速凝固而引起。8、切片及粘片：(1)將修整好的包埋組織蠟塊固定于持蠟器上。

2）準備好毛筆，盛蠟帶的玻璃紙盒（或木盤），清潔機件和刀的擦布，眼科鑷子，小解剖刀及粘附刀片用的溫水和“蛋白甘油”。（3）從盒中取出切片刀，用布擦去油跡，必要時在顯微鏡下檢查刀刃。將切片刀裝上切片機持刀臺。然后將預定使用的刀口移至蠟塊膠塊的下方。刀的傾角一般以4－6度為適當（傾角是指刀刃與蠟塊平面所成的角）。如傾角過大則切片上卷，過小則切不成完整切片。（4）固定好切片刀后，松開轉輪固定器，使轉輪緩慢下降至蠟塊膠塊稍離刀口為止，然后調整厚度指針（5－10微米）即可切片。（5）石蠟切片的粘貼方法：①展片臺法：展片前取干凈載玻片滴“蛋白甘油”一滴于切片中央，用小指輕輕涂抹均勻，然后滴加蒸餾水1滴，用小鑷子夾取切好的蠟片，使其浮于水面上，擺正位置后在酒精燈火焰上方適度加熱至蠟片舒展?；蚍胖糜陬A先加熱的展片臺上（溫度保持在4045C）。此時蠟片因受熱而伸展攤平。放入溫箱（37C）—晝夜使其干燥，蠟片即可以粘牢。②撈取法：以器皿盛溫水或用恒溫水浴鍋使溫度保持約48C左右，將蠟片攤于水面上，蠟片受熱便自然打開，然后用涂有“甘油蛋白”的載片伸入水中，將蠟片移至玻片上，調整位置，傾區(qū)多余的水分后溫箱干燥。蛋白甘油的配制：鮮蛋白30毫升，純甘油30毫升，麝香草酚0.1—0.2克。將鮮蛋白放入燒杯內，加入麝香草酚，然后用玻璃棒充分攪拌，再加入甘油繼續(xù)攪拌，最后用粗濾紙或棉花過濾即可使用，此液放入冰箱可保存數(shù)月。8、脫蠟復水：石蠟切片經(jīng)二甲苯（A） （B）脫蠟各510min,然后放入100%95%90%80%7%0等各級酒精溶液中各35min,再放入蒸餾水3min.8染色：蘇木精一伊紅染色法（H.E染色法）：（1）蘇木精染液（Mayer蘇木精染液改良法的配制）：甲液—蘇木精1g甲液—蘇木精1g無水乙醇50ml冰醋酸5ml甘油50ml乙液一鉀磯（硫酸鋁鉀）5g蒸餾水50ml后加碘酸鈉0.2g配制時，蘇木精溶于約15ml無水乙醇中，加冰醋酸后攪拌。當蘇木精溶解后倒入甘油并搖動容器，同時加入其余的酒精（甲液）。鉀磯在研缽中研碎后加熱，然后將它溶解于水中（乙液）。將溫熱的乙液一滴一滴地加入到甲液中，并隨時攪動?；旌贤戤吅?，加入0.2g碘酸鈉，使其成熟。（2） 伊紅染液（酒溶性伊紅）：伊紅Y 1 克95%酒精 100 毫升冰醋酸 10 滴把伊紅溶于酒精中，后加入冰醋酸一小滴。還可以加入少許麝香草酚以防腐。（3） 染色步驟：蘇木精染色：氧化蘇木精染液染細胞核2030min（20C）。自來水沖洗15min后，蒸餾水洗5分鐘（沖洗過程中，鏡檢見切片顏色發(fā)藍）。伊紅染色：蘇木精染色水洗后，切片在50%70%80%90匯醇中各35min后，伊紅染細胞質2—5分鐘。染色后再次脫水透明（步驟如下）：9、封固：切片經(jīng)染色、脫水、透明后即可用封藏劑把它封固起來。封固目的為使切片能永久保存便于鏡檢。作為封固劑必須要能與透