不同日齡乳鼠人工乳的研制

不同日齡乳鼠人工乳的研制

無菌動(dòng)物是沒有生命的動(dòng)物。這些生命包括細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲。該級別動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)可以消除外源性生物的干擾，顯著提高實(shí)驗(yàn)的敏感性和重復(fù)性。無菌動(dòng)物已在生物、醫(yī)學(xué)等方面得到廣泛應(yīng)用。20世紀(jì)40年代美國圣母大學(xué)Lobund實(shí)驗(yàn)室的Reyniers等首次培育出能連續(xù)傳代的無菌大鼠。其后Gustafsson、Miyakawa、Pleasants和王蔭槐等也建立了無菌大鼠。在建立無菌大鼠的所有環(huán)節(jié)中,人工奶的配方是最重要的。Reyniers、Gustafsson、Miyakawa、鷲見幸子和王蔭槐等公布了他們的配方。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn):按照國外學(xué)者的配方和王蔭槐的RT-89乳配方配制的人工乳非常稀薄,這種性狀的乳在用吮吸法飼喂乳鼠時(shí),人工乳易從乳頭中自行流出,乳鼠吮吸時(shí)極易吸入過多的乳汁,如果乳鼠不能及時(shí)將這些乳汁吞咽至胃內(nèi)的話,將會把乳汁吸入呼吸道內(nèi),造成異物性支氣管肺炎、窒息甚至死亡。即使沒有死亡的乳鼠,多數(shù)生長發(fā)育明顯遲緩,離乳體重明顯偏輕,沒有生育能力。而按照王蔭槐的RT-91配方配制的人工乳,經(jīng)過高壓滅菌后乳汁完全凝固。喂乳之前需要用組織勻漿器將乳充分研磨并稀釋。但是將人工乳稀釋到什么程度完全憑經(jīng)驗(yàn)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn):乳鼠在生長發(fā)育過程中,其吮吸力不斷增加,而且對營養(yǎng)的需求也不斷增加。針對這些特點(diǎn),作者研制了系列人工乳;隨著乳鼠的生長,不斷調(diào)整配方,增加乳的粘稠度和營養(yǎng)成分。這種采用多種配方和不同粘稠度的人工乳飼喂無菌大鼠國內(nèi)外尚未見報(bào)道。1材料和方法1.1試驗(yàn)材料1.1.1上海生物活性制品有限公司維生素A、維生素D、維生素E、維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12、維生素C,杭州民生藥業(yè)集團(tuán)有限公司出品。蛋氨酸、色氨酸、賴氨酸,中科院上海生化所生產(chǎn)。蛋白質(zhì)粉,安利中國日用品有限公司提供。荷蘭乳牛全脂奶粉,紐迪希亞(黑龍江)營養(yǎng)制品有限公司生產(chǎn)。乳糖,上海恒信化學(xué)試劑有限公司出品。大鼠血清、兔乳,浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。雞蛋,市場購買。1.1.2動(dòng)物SPF級SD品系的懷孕母鼠由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及設(shè)備軟塑隔離器(1200mm×600mm×800mm),蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司生產(chǎn);手術(shù)隔離器(800mm×600mm×800mm),中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所出品。1.2測試方法1.2.1wf-3,1115日齡乳鼠和1626日齡乳鼠的生長情況根據(jù)乳鼠不同日齡配制不同的人工乳(LWF)。0～2日齡乳鼠用LWF-1,3～5日齡乳鼠用LWF-2,6～10日齡乳鼠用LWF-3,11～15日齡乳鼠用LWF-4,16～21日齡乳鼠用LWF-5,16～26日齡乳鼠用LWF-6(表1)。按照不同的配方組成量取各種成分,將奶粉按比例溶解于水,然后和大鼠血清、兔乳、乳糖、蛋氨酸、色氨酸和賴氨酸等成分進(jìn)行混合并完全溶解,121℃高壓滅菌30min,各種維生素用γ射線以40kGy劑量進(jìn)行照射,將維生素和高壓滅菌的人工乳在滅菌隔離器內(nèi)充分混合。1.2.2lw的主要營養(yǎng)成分含量的測定每種配方奶至少測定3批。為了與文獻(xiàn)能進(jìn)行對比,測定結(jié)果和所引文獻(xiàn)一樣,采用區(qū)間表示的方法。2蛋白質(zhì)測試依據(jù)GB/T5413.1-1997,運(yùn)用半微量凱氏定氮法測定。脂肪試驗(yàn)依據(jù)GB/T5009.6-2003,選用酸水解法測定。2總糖的測定依據(jù)GB/T5413.5-1997,選用萊因-埃農(nóng)氏法測定?？偺菫槿樘呛驼崽侵?。氯的測量依據(jù)GB/T12457-90,選用電位滴定法測定。2鈣、鈉和鉀的測定依據(jù)GB/T5413.21-1997,運(yùn)用原子吸收分光光度法測定。3灰燼測試依據(jù)GB/T5413.7-1997,人工乳于600℃以下灼熱、灰化所得殘留物的質(zhì)量即為樣品的灰分,以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示。磷測定依據(jù)GB/T5009.87-2003,選用分子吸收光譜法測定。2粘度試驗(yàn)使用旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)NDJ-1(上海天平廠生產(chǎn))進(jìn)行直接測定,轉(zhuǎn)子速度為12r·min-1。1.2.3隔離器消毒安裝好隔離器后檢漏,未發(fā)現(xiàn)漏氣的隔離器用2%的過氧乙酸進(jìn)行噴霧滅菌。1.2.4乳鼠的吸血量檢測采用吮吸法進(jìn)行人工哺乳。準(zhǔn)確判斷孕鼠分娩時(shí)間,臨產(chǎn)孕鼠用CO2麻醉后進(jìn)行無菌子宮摘取術(shù).將摘取的子宮傳入無菌隔離器,在隔離器內(nèi)剝離子宮,取出胎鼠,并于兩小時(shí)后進(jìn)行人工哺乳.依次連接注射器、硅膠管和人工乳頭,根據(jù)乳鼠日齡的不同選用相應(yīng)的人工乳,將人工乳充滿這些器具。左手固定乳鼠頭部,右手持人工乳頭,然后將乳頭插入乳鼠口中。觀察注射器內(nèi)的液面變化情況。如果出現(xiàn)液面下降,說明乳鼠開始吸吮。流速控制在0.2mL·min-1以內(nèi).人工哺乳進(jìn)行至乳鼠21日齡,而LWF-6一直飼喂至乳鼠26日齡。剖腹產(chǎn)獲得的仔鼠,每批隨機(jī)選擇10只進(jìn)行人工哺乳,飼喂3批總共30只乳鼠。每日人工哺乳6次,4h1次,晝夜連續(xù)進(jìn)行,每日哺乳量約為乳鼠體重的20%。刺激乳鼠排尿排便3次。另外,以剖腹產(chǎn)所得的仔鼠,每批隨機(jī)選擇10只乳鼠給剛分娩的無菌大鼠進(jìn)行代乳,試驗(yàn)3批共30只乳鼠,作為人工哺乳鼠的對照。每天定時(shí)稱量這些乳鼠體重,并記錄離乳率(離乳動(dòng)物數(shù)量/開始哺乳時(shí)動(dòng)物的數(shù)量×100%)。在人工哺乳鼠達(dá)到16日齡時(shí),除了定時(shí)定量飼喂LWF-5外,開始加喂LWF-6。起初每天在乳鼠口中1次放入0.3g的LWF-6,每日3次,一般3次后就可以自行覓食。1.2.5教育能力隨機(jī)選擇8對100日齡以上的AR無菌大鼠進(jìn)行交配,觀察其生育能力。1.2.6動(dòng)物糞便、統(tǒng)一口腔棉t依據(jù)GB/T14926.41-2001、GB/T14926.42-2001和GB/T14926.43-2001,由浙醫(yī)一院檢驗(yàn)科每周對動(dòng)物糞便、毛發(fā)和口腔棉拭子進(jìn)行檢測。1.2.7動(dòng)物體重和體重的統(tǒng)計(jì)描述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件處理,動(dòng)物體重用xˉ±sxˉ±s表示,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異.2結(jié)果2.1人工乳的理化性質(zhì)和粘稠度以及ph值的變化高壓滅菌后除LWF-6為固體外,其他幾種LWF均為液體。不同的LWF其蛋白質(zhì)、脂肪、總糖、灰分、鈣、磷、鈉、鉀、氯、熱量等成分含量、粘稠度以及pH值不同。隨著乳鼠日齡的增加,其相應(yīng)配方中蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、能量和粘稠度等都不斷增加。灰分、鈣、磷、鈉、鉀、氯等成分也有不斷升高的趨勢。各人工乳的pH值變化不大。除LWF-6外,其余配方的各營養(yǎng)成分均在已報(bào)道的大鼠乳各營養(yǎng)成分含量的范圍以內(nèi)(表2)。2.2日被毛生長情況AR乳鼠3日張耳,8日長牙,10日被毛,13日睜眼.和MR鼠生長情況基本一致.21日離乳,離乳率為73.3%,MR乳鼠為100%.2.3遠(yuǎn)離乳房前的生長曲線AR無菌大鼠體重不斷增長,明顯低于MR鼠(2日齡時(shí)P<0.05,3日齡時(shí)P<0.01)的體重增長(圖1).2.4無菌大鼠的生育能力隨機(jī)選擇的8對AR無菌大鼠都具有生育能力.妊娠期21～23d,產(chǎn)仔鼠數(shù)為6～12只,新生鼠體重為4.2～6.8g.2.5微生物檢測整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中微生物檢測均為陰性。3營養(yǎng)品質(zhì)對乳鼠的影響運(yùn)用動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)無菌大鼠人工乳粘稠度和營養(yǎng)成分的方法飼喂乳鼠,乳鼠生長良好,雖然離乳體重明顯低于代乳鼠,而無菌的人工哺乳鼠體重明顯低于代乳鼠體重,這一現(xiàn)象與文獻(xiàn)報(bào)道的一致,這個(gè)問題現(xiàn)在仍是世界上未解決的難題。到性成熟時(shí),這些鼠都具有生育能力,說明這種方法是有效的。給大鼠新生鼠僅僅飼喂全牛奶對于其生長發(fā)育完全不夠,因?yàn)榇笫笕榈牡鞍缀繛?%左右,明顯高于牛乳4%的蛋白含量?，F(xiàn)在國外報(bào)道的人工喂養(yǎng)乳配方以牛乳為主要成分,然后加入了煉乳、酪蛋白等牛乳制品,以提高人工乳的營養(yǎng)主要是蛋白質(zhì)的濃度。由于兔乳含有約10%的蛋白質(zhì),而大鼠血清的蛋白含量約為6.2%。因此選用兔乳和大鼠血清可以提高人工乳的蛋白質(zhì)含量。按照LWF配制的乳其重要營養(yǎng)成分含量均接近于大鼠母乳。另外,本試驗(yàn)中沒有添加礦物質(zhì),因?yàn)榭紤]到牛乳、兔乳和大鼠血清中都含有這些成分,而且這些成分在高壓滅菌的過程中不會被大量破壞。蛋氨酸、賴氨酸和色氨酸是大鼠飼料中的限制性氨基酸,適量加入這些氨基酸可以促進(jìn)大鼠對于其他氨基酸的吸收。配方中沒有加入所有的維生素,僅僅增添了一些主要維生素。原因是維生素在消毒滅菌過程中沒有被完全破壞,并且沒有被破壞的維生素的含量足夠乳鼠生長需要。很少有人采用吮吸法給乳鼠進(jìn)行人工喂乳,一些學(xué)者甚至認(rèn)為運(yùn)用這種方法給乳鼠喂進(jìn)去人工乳的量太少,所以就放棄了這種方法。吮吸是乳鼠的本能反應(yīng),剛出生的就會吮吸,但是吮吸的力量不強(qiáng)。通過控制人工乳的粘稠度可調(diào)節(jié)乳汁的流動(dòng)性,如果人工乳的粘稠度合適,人工乳的流動(dòng)阻滯力和乳鼠的吮吸力恰好相當(dāng),則乳鼠可以平穩(wěn)地從人工乳頭內(nèi)吮吸乳汁而很少出現(xiàn)將乳吸入氣管引起窒息的現(xiàn)象。如果人工乳的粘稠度過高,阻滯力超過其吮吸的力量,乳鼠無法順利地將人工乳吸入胃內(nèi),反而會將空氣吸入胃,這樣乳鼠攝入的乳汁所含有的營養(yǎng)量明顯少于乳鼠生長發(fā)育所需要的量,乳鼠多數(shù)會在幾天內(nèi)因?yàn)闋I養(yǎng)不良而死亡。隨著乳鼠的生長,其吮吸力也在增加,這時(shí)改變?nèi)斯と榈慕M分,相應(yīng)提高人工乳的粘稠度,并且同時(shí)提高人工乳的營養(yǎng)成分,這樣既保障了乳鼠進(jìn)食安全,又滿足了其對營養(yǎng)的需求。另外,在乳鼠睜開眼睛后,到處尋找食物,這時(shí)增加固體食物(LWF-6)以訓(xùn)練乳鼠的覓食和咀嚼功能。還有一個(gè)值得注意的現(xiàn)象,采用王蔭槐RT-91配方配制的人工乳,如果研磨不是很細(xì)的話,其研磨后的乳內(nèi)含有較多的顆粒,這樣的乳被乳鼠攝入