層析介質(zhì)分類及研究進展

層析介質(zhì)分類及研究進展摘要：層析是蛋白質(zhì)純化的關(guān)鍵技術(shù)之一，作為層析技術(shù)的核心——層析介質(zhì)一直以來是層析技術(shù)研究的一個熱點。最近幾年來，愈來愈多的新型層析介質(zhì)被開發(fā)出來，如粒度均勻的交聯(lián)多糖、人工合成的大孔聚合物、觸角型吸附劑、軟膠包裹在硬膠表面等介質(zhì)。本文主要綜述了層析介質(zhì)的分類、組成、特性和研究進展，及其與之相關(guān)的應(yīng)用較為普遍的層析技術(shù)。同時，結(jié)合我國的實際情形，就當(dāng)前層析介質(zhì)面臨的挑戰(zhàn)和未來的進展進行討論并提出了建議。關(guān)鍵詞：層析介質(zhì)，分類，研究進展Abstract：Chromatographyisoneofthemostimportantpurificationtechniquesofproteins．Theattentionofchromatographershashithertofocusedonmediawhichisregardedasthekeyforchromatographytechnology．Inrecentyears，variousnewmediausedinproteinchromatographyhavebeendeveloped，suchashomogeneouscrosslinkingpolysaccharide，syntheticorganicpolymers，tentaclesorbentsandsoftgelinarigidshell，etc．Thispaperreviewsthechromatographymedia,includingtheirsort,composition,characteristicsandresearchprogress.Meanwhile,associatingwiththefactsofChina,thechallengesofchromatographymediaarediscussedandthescopeforfutureworkishighlighted.Keywords:chromatographymedia;classify;researchprogress層析技術(shù)是目前普遍應(yīng)用的一種分離技術(shù)，是利用不同物質(zhì)理化性質(zhì)的不同而成立起來的技術(shù)。而在眾多的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)中，層析是一門關(guān)鍵技術(shù)，和其它分離技術(shù)相較，層析技術(shù)具有分離效率高、適用性廣和進程易于放大、易于自動化的特點，因此取得了普遍的應(yīng)用。而層析技術(shù)的核心是層析介質(zhì)，選擇適合的層析介質(zhì)、應(yīng)用合理的工藝條件已成為蛋白質(zhì)層析技術(shù)的關(guān)鍵，這就要求對當(dāng)前主要的層析介質(zhì)有所了解。下文對層析介質(zhì)的進展概況進行介紹，并探討層析介質(zhì)的應(yīng)用技術(shù)。層析介質(zhì)的分類按照層析技術(shù)的類型能夠?qū)游鼋橘|(zhì)分為：凝膠過濾介質(zhì)、離子互換介質(zhì)、疏水作用層析介質(zhì)、反相層析介質(zhì)和親和層析介質(zhì)等。就介質(zhì)的骨架而言，最初主如果天然高分子物質(zhì)，都為多糖如纖維素、葡聚糖和非交聯(lián)的瓊脂糖凝膠，其特點是親水性好、生物相容性高，缺點是質(zhì)地較軟、不耐壓、流速慢，一般稱之為軟膠（softgel）。隨著對蛋白質(zhì)分離要求的不斷提高，客觀上推動了蛋白質(zhì)層析介質(zhì)的進展，在過去的十幾年中，新型的層析介質(zhì)被不斷地開發(fā)出來，大體上能夠分為以下幾類：1）粒度均勻的珠狀交聯(lián)多糖。在保證了經(jīng)典多糖介質(zhì)良好的吸附性能的基礎(chǔ)上進行交聯(lián)，不但增加了強度，而且較窄的粒徑散布提高了分離效率。如交聯(lián)瓊脂糖凝膠，商品化的有AmershamBiosciences生產(chǎn)的SepharoseFastFlow、Seph—aroseHighPerformance等系列。2）人工合成的大孔聚合物?；谶@種填料的層析被稱為灌注層析，其特點是在介質(zhì)中除有小的擴散孔，還有大的穿透孔，從而大大加速傳質(zhì)，增加流速。最先商業(yè)化的產(chǎn)品是PerSeptiveBiosystems公司1989年推出的Poros系列，目前還有Ciphergen公司的HyperD系列。另外還有一類區(qū)別于傳統(tǒng)珠狀介質(zhì)的填料采用整塊多孔聚合物（monolithporouspolymer），其合成是在“密閉柱"中進行的，不過內(nèi)徑較大的柱的合成比較困難。3）觸角型（tentaele）吸附劑。這種介質(zhì)通過增加距離臂和有效官能團來增加活性配基與蛋白質(zhì)的彼此作用，從而提高效率，如Merck公司的FractogelEMD系列。4）軟膠包裹在硬膠表面（softgelinarigidshell）。這種介質(zhì)最大的特點是結(jié)合了軟膠（如瓊脂糖）良好的吸附性能和無機材料（如硅膠）的剛性長處，如Ciphergen公司的Sphero一dex系列。層析介質(zhì)的應(yīng)用技術(shù)離子互換層析離子互換層析是利用離子互換劑與離子的作使勁強弱不同，選擇性地吸附或釋放有價值的離子，從而達到去除雜質(zhì)、富集或純化目標(biāo)生化物質(zhì)的目的。在生物醫(yī)藥行業(yè)中，普遍應(yīng)用于抗生素、氨基酸和有機酸等生化小分子物質(zhì)的提取，也大量用于蛋白質(zhì)、酶和多糖等生物大分子的分離純化。原則上，在某一條件下，只要目標(biāo)生化物質(zhì)能離子化，就可以夠采用離子互換技術(shù)進行分離、純化。最先應(yīng)用于生物大分子分離純化中的離子互換介質(zhì)是纖維素離子互換劑，纖維素高度的親水性能與蛋白質(zhì)有專門好的相容性，但其缺點也顯而易見：容量低、流速慢。后來，珠狀交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖、交聯(lián)纖維素被開發(fā)出來，離子互換介質(zhì)的性能取得了極大的改善，這也是目前仍取得普遍應(yīng)用的離子互換介質(zhì)。最近幾年來，隨著合成技術(shù)的進展和生產(chǎn)的需要，人工合成的剛性材料被陸續(xù)開發(fā)出來，這也是未來離子互換介質(zhì)進展的一個趨勢。目前，商品化的離子互換層析介質(zhì)品種很多（見表1）。茗稱配基%-関A日呼liedDEAEXMCdtjlvBcWhilmanDMIi.LM.SE.P(.■erauur□ph朗和!Q.SrPEAE.OlFniHlt^rlF.Mf^TM.lE川EAEaDMAE.￡.ljO,SE.別張“mHMomiPrrfiBifrRadgDEJtE觀點MatrfT!以札曲耐MiHipjtf珠:上龍議訐唯宦QrDFAR.l^.htimA^rnsh^nnBi^cirmTes余朮性聚髒類XMilnOAiDcrshainHiasriew帝水件型驟吳PomPcrScpt^D?5F5l￡Jlli橐茬己旳Q^DsS^E^r.lM加“襯AwhtLsRi*』?卻?曲DRjLEAnm-hamBkectenc曲交QAF,DHAE.CMfiPCLAwsJidniBiascifmcrs交聯(lián)瓊〕&威DFAE,CHSrphzuwFtpiFb.AirrJidnji交聯(lián)瓊侶吐Q.DE：VF：.ANXXM,3Stphua^-111臨Anen-lum交聯(lián)蘋惜倉Q.SPSoincrA^nhdmEkofrimtihCipitr^WnUUE.SPSphfiMsilCiphrrfren經(jīng)愛合斯低卅旳多孔便査QUA.險呻sffiT<^diaa^電甲扯丙掘離篇9AE.DME,(JM^PTriawrylMii^Sl：iph#僭,門耗ft兩焜轅棄訃氧DE^E.CM.SPRKCd.Tm曲砂GJOOO菇*亞表1.用于蛋白質(zhì)制備的離子互換層析介質(zhì)凝膠過濾技術(shù)凝膠過濾是依照生物大分子物質(zhì)（如蛋白質(zhì)）的分子量大小進行分離的技術(shù)。其按照不同分子量（或分子大?。┑娜苜|(zhì)分子在凝膠結(jié)構(gòu)內(nèi)相溶液與外相溶液之間的分派關(guān)系不同而分離的，主要用于生物大分子物質(zhì)的脫鹽、分級分離和分子量測定等。脫鹽是分離大小不同的兩類物質(zhì)，常指無機鹽與生物大分子間的分離；分級是將分子大小相近的物質(zhì)分開，一般為大分子間的分離。凝膠過濾具有：①分離條件溫和，蛋白質(zhì)收率高，重現(xiàn)性好；②工作范圍廣，分離分子量覆蓋面大；③設(shè)備簡單、易于操作；④周期短，無需再生，可持續(xù)利用等許多長處。凝膠過濾介質(zhì)的性能是獲取上述長處的基本保證，表征凝膠過濾介質(zhì)性能的參數(shù)一般有：排阻極限、孔容、分級范圍、水滯留量、粒徑及粒徑散布等。粒徑及粒徑散布影響其柱效，孔容則關(guān)系到凝膠色譜柱的分離容量。凝膠介質(zhì)應(yīng)具有以下條件：①介質(zhì)本身為惰性物質(zhì)，在應(yīng)用進程中它不與溶質(zhì)、溶劑發(fā)生任何作用。②應(yīng)盡可能減少介質(zhì)內(nèi)含的帶電離子基團，以減少非特異吸附件，提高蛋白質(zhì)的收率，不然，采用離子強度大于mol/L的緩沖液消除非持異吸附效應(yīng)。③介質(zhì)孔徑散布應(yīng)較窄。④粒徑分布應(yīng)較窄。⑤介質(zhì)要具有優(yōu)良的物理化學(xué)穩(wěn)固性及較高的機械強度以增加利用壽命。常常利用凝膠過濾介質(zhì)的骨架主要有天然多糖類和合成大分子：①多糖類骨架的介質(zhì)主要為纖維素、葡聚糖及瓊脂糖等。以天然多糖為母體的凝膠過濾介質(zhì)是“經(jīng)典”的分離生物大分子的材料。這種介質(zhì)具有親水性及與生物大分子的相容性，可允許生物大分子透過而不發(fā)生變性。這種介質(zhì)原多為軟基質(zhì)，壓力降大，不易操作。最近幾年來合成工藝不斷改良，生產(chǎn)出剛性、半剛性的骨架，出現(xiàn)了適用于高流速且具有高分辨率的新產(chǎn)品以知足生產(chǎn)規(guī)模的需求。除單一的多糖骨架外還出現(xiàn)了瓊脂糖與葡聚糖接枝而成的復(fù)合凝膠Superdex高效過濾介質(zhì)。②合成大分子骨架的介質(zhì)是在吸取多糖類骨架親水性長處，克服其易受微生物侵蝕的缺點，選用高親水性單體，經(jīng)共聚反映并控制孔結(jié)構(gòu)而合成的介質(zhì)。主要有聚丙烯酰胺類、聚乙烯醇系及含羥甲基酰胺類的新型介質(zhì)。疏水作用層析是按照分子表面疏水性不同來分離蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的一種較為常常利用的方式。通過三十連年的進展，HIC已成為分離純化蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的重要手腕。HIC技術(shù)在實驗室和工業(yè)化生產(chǎn)中取得了普遍的應(yīng)用。HIC介質(zhì)的重要特點是疏水性弱，與蛋白質(zhì)的作用比較溫和，能更好地維持生物大分子的天然結(jié)構(gòu)和生物活性。另外，其“高鹽吸附、低鹽洗脫”的特點使得HIC能直接與其它分離技術(shù)如鹽析、離子互換層析聯(lián)合利用。目前用于制備用途的HIC介質(zhì)的基質(zhì)主要有多糖類如瓊脂糖、纖維素和人工合成聚合物類如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯類。其中，半剛性的瓊脂糖類凝膠仍是應(yīng)用最普遍的疏水介質(zhì)。Gustavsson等⑷最近研制了超大孔(superporous)瓊脂糖作為疏水層析介質(zhì)的基質(zhì)，在擴散孔的基礎(chǔ)上增加了對流孔，傳質(zhì)速度快，能在流速較高的情形下取得較好的分辨率。另外，由于殼聚糖具有良好的生物相容性和化學(xué)穩(wěn)固性，最近幾年來在疏水層析中也取得了應(yīng)用［5］。用于HIC介質(zhì)的疏水配基很多，如羥丙基、丙基、芐基、異丙基、苯基、戊基、辛基等。通常，配基通過穩(wěn)固的非離子鍵(如醚鍵)與基質(zhì)結(jié)合，圖1列出了幾種常常利用的配基結(jié)構(gòu)及其與配基的聯(lián)接方式。迄今為止，普遍利用的商品化制備型HIC介質(zhì)配基仍是烷基和芳基，常見的商品化制備型HIC介質(zhì)見表2。SAjilI就憂■密度MI.jm-.l'nil1啾圍乎嘩五了―甲<4仏0邸?MA1>23剋強M*:n?-prepmethii丙基1.PK的)MASU-4fl1-時25呷密詳潢AFranhy|f:|FMITRn單jA45-訂50EuiyliSqJijrT4FT1SI卻1-14未知>13酣AE53-L25I-BEunyleflEufjMI?■歩知未5sToy?jpfi*rljKityt-OSOMA*Xifl走知ToropeuLb?fl-65fl'電1-U第i.y如門刑0N4rnfllSAiFnrjrji*XLH■UMTC%HIV■fll”]MISi/A21怕3-12252+mgHSAPbenR沖皿神flF忤15Z-I2耒燔末知SOUBCRlS-f-HfcS3-12513.Pfenvl胡中如-4&H呻鄭祥送白：FEcborelLMl)I'hfinYl朮如?第知礦?窈亦dRirnxlMA■<未知T旳jitifIPtirnyl-ifi^Q怡去問末呂P?H氏*S-1Mid)A.4J-I6J3--13OcEylScpIiBnwr：?FFC影?1巧"洛未SiOd^icetiLifiw-PSSOUIMSK1SCTHHE耳f&hi帰帥刖_ptTSKpdeiherM未XTayopcErJL^lkrIrMl表2.主要的商品化制備型HIC介質(zhì)最近幾年來，隨著層析技術(shù)的進展，與HIC相關(guān)的其它層析技術(shù)也取得了進展，主要有以下兩種：親硫性疏水層析(thio—philicchromatography)、疏水電荷誘導(dǎo)層析(HCIC)。親硫性疏水層析：親硫性疏水層析技術(shù)主要在疏水作用的基礎(chǔ)上增加了硫元素的彼此作用。利用層析介質(zhì)與含硫蛋白質(zhì)和非硫蛋白質(zhì)的親硫性不同，對蛋白質(zhì)加以分離。具體應(yīng)用條件和HIC類似。通常這種介質(zhì)通過硫醚鍵將配基和基質(zhì)聯(lián)接，如Butyl—S-Sepharose6FastFlow，已用于乙肝病毒表面抗原的分離純化［6。］疏水電荷誘導(dǎo)層析：HCIC是近幾年來進展起來的一類不同于HIC的新技術(shù)，最先由Burton等于1998年提出。HCIC與蛋白質(zhì)的作用除疏水作用，還有電荷間的彼此作用。HCIC與蛋白質(zhì)的結(jié)合是由疏水作用推動的，與HIC不同的是，這一進程一般是在不改變離子強度的條件下實現(xiàn)的，洗脫時也不像HIC那樣通過改變鹽的濃度而是由pH值的改變來實現(xiàn)的。3．層析技術(shù)的應(yīng)用及其相關(guān)的介質(zhì)層析技術(shù)有很多類型，以上提到的這些蛋白質(zhì)層析技術(shù)不是在每一種蛋白質(zhì)的純化中都要用到，事實上在能達到純度要求的情形下，應(yīng)盡可能利用較少的純化步驟，以提高產(chǎn)率、節(jié)約本錢。但實際進程中，往往需要幾種層析技術(shù)加以聯(lián)合利用，才能達到產(chǎn)品的純度要求，如何更好的利用這些層析技術(shù)，AmershamBiosciences公司的技術(shù)人員針對蛋白質(zhì)層析的特點提出了“三相純化策略"(threephasepurificationstrategy)，這三步別離是：富集(capturestep):對目標(biāo)蛋白質(zhì)進行初步純化，去除那些與目標(biāo)蛋白質(zhì)性質(zhì)不同專門大的物質(zhì)，如細胞的DNA、RNA等；另外，尤其重要的是去除那些對目標(biāo)蛋白質(zhì)不穩(wěn)固的物質(zhì)如各類蛋白酶，以達到富集濃縮、穩(wěn)固目標(biāo)產(chǎn)物的目的。通常應(yīng)用的層析技術(shù)有離子互換、疏水作用、親和層析，對層析介質(zhì)的要求是流速快、載量大。2）中間純化（intermediatestep）:進一步純化目標(biāo)蛋白，去除那些在分子大小、理化性質(zhì)與目標(biāo)蛋白質(zhì)類似的雜質(zhì)，通常采用與富集時不同的層析技術(shù)，對分離介質(zhì)的要求是選擇性好（分辨率高）、載量大，通常應(yīng)用顆粒較小的介質(zhì)。3）精制（polishingstep）:最終去除那些痕量雜質(zhì)，達到產(chǎn)品的純度要求，凝膠過濾是這一步中常常利用的層析技術(shù)，對分離介質(zhì)的要求集中在高選擇性上。層析介質(zhì)的研究進展層析介質(zhì)正朝著品種多樣化、性能高效化的方向進展。為了知足生產(chǎn)的需要，愈來愈多的人工合成或復(fù)合型的剛性材料被開發(fā)出來，提供了高流速、高選擇、高載量及可操作性的介質(zhì)，相信這也是未來蛋白質(zhì)層析介質(zhì)進展的趨勢。目前層析介質(zhì)的研究方向有以下幾點：1）用低價、生物相容性好的基質(zhì)材料制備層析介質(zhì)多糖類的天然高分子材料能夠作為介質(zhì)的基質(zhì)，如纖維素、殼聚糖。由于價廉和生物相容性好的兩大長處能夠取代瓊脂糖成為蛋白質(zhì)分離的理想填料。也可將它們和其它聚合物涂層或混融制備填料基質(zhì)。2）良好的致孔技術(shù)介質(zhì)的動力學(xué)性能取決于內(nèi)部的孔結(jié)構(gòu)，只有擁有均勻的、大小適合的孔徑散布才能有好的動力學(xué)性能，才能最大限度發(fā)揮填料的互換（吸附）作用和選擇性能。采用多種類的致孔劑造孔于天然高分子和全合成聚合物是填料進展面臨的最大挑戰(zhàn)。3）開發(fā)大顆粒的耐壓性能好的全合成聚合物顆粒的增大降低了操作反壓，提高了流速，給大規(guī)模生產(chǎn)操作帶來極大的便利，相應(yīng)的設(shè)備投資能夠大大降低，可是顆粒的增大會造成破裂，因此在具有良好的孔結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上還要保證介質(zhì)具有耐壓的性能。4）研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的通用型介質(zhì)通用型介質(zhì)在分離進程中主要用于富集和中間純化步驟，用量大，它的本錢投入較大，對生物藥物的價錢起到杠桿作用。因此我國生物制藥的進展要立足咱們自己研發(fā)的分離介質(zhì)，而不能長期依賴入口介質(zhì)。討論層析技術(shù)作為目前應(yīng)用較為普遍的分離技術(shù)已經(jīng)取得重視，而層析介質(zhì)在層析技術(shù)中起著超級重要的作用，可是當(dāng)前的介質(zhì)仍然存在著或多或少的問題，因此咱們需要綜合各類介質(zhì)的優(yōu)缺點后再應(yīng)用于各類實踐中，或改良現(xiàn)有的介質(zhì)，以便更好發(fā)揮層析介質(zhì)的作用，從而達到咱們的目標(biāo)。參考文獻Baosx（鮑時翔），YaoRH（姚汝華）.Separationandpurificationofproteinandrecentadvancesinchromatography．JournalofSouthChinaUniversityofTechnology（NaturalScience）（華南理工大學(xué)學(xué)報?自然科學(xué)版），1996，24（12）：98—103XieS，AningtonRW，F(xiàn)r6ehetJMJeta1.Porouspolymermonoliths：analternativetoclassicalbeads.AdvBiochemEngBiotechnol，2002，76：88—125孟慶強，喬昕，馬輝煌.疏水層析蛋白質(zhì)動力學(xué)與平衡進程的考察