不同損傷方式誘導(dǎo)的兔椎間盤退變模型的比較

不同損傷方式誘導(dǎo)的兔椎間盤退變模型的比較

椎間盤退行性疾?。╠d）是臨床常見病和常見疾病，但目前關(guān)于性別和病理生理的系統(tǒng)尚不完全清楚。建立可靠的椎間盤退變動(dòng)物模型,能夠?yàn)檠芯緿DD的發(fā)病機(jī)制提供有利條件,為治療DDD的各種探索研究提供良好的實(shí)驗(yàn)載體?，F(xiàn)已建立的各類動(dòng)物模型多屬誘發(fā)性退變模型,其中以通過直接損傷椎間盤結(jié)構(gòu)引發(fā)退變的模型應(yīng)用最廣泛。但目前對(duì)不同手術(shù)損傷方式誘導(dǎo)的退變模型之間進(jìn)行比較的研究較少,對(duì)于椎間盤退變模型的選擇仍有許多不同意見。我們的研究采用生化檢測(cè)和影像學(xué)檢查方法,對(duì)3種不同手術(shù)損傷方法建立的椎間盤退變動(dòng)物模型的退變過程及其特點(diǎn)進(jìn)行觀察和比較,以期為DDD的相關(guān)研究中動(dòng)物模型的選擇提供參考依據(jù)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)分組和分組健康6月齡新西蘭大白兔25只,雌性14只,雄性11只,體重2.0~2.5kg,由四川大學(xué)華西醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。經(jīng)MRI和CR檢查排除脊柱的先天性畸形和椎間盤退變。隨機(jī)分為18G針頭纖維環(huán)穿刺組(A組)、22G針頭纖維環(huán)穿刺組(B組)、髓核抽吸組(C組)、終板破壞組(D組)和假手術(shù)對(duì)照組(E組)。每組5只動(dòng)物,標(biāo)準(zhǔn)條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。1.2g頭皮穿刺組所有動(dòng)物以10%水合氯醛(0.3mL/kg)腹腔注射全麻。腰背部剃毛備皮約20cm×15cm后,取側(cè)臥位固定四肢。各組均采用經(jīng)側(cè)方腹膜外入路,顯露椎間盤后分別采用以下方法造模。A、B組:采用Masuda等的方法,分別用18G和22G針頭在L3、4、L4、5、L5、6椎間盤進(jìn)行穿刺。以針頭帽制作的套筒為保護(hù)裝置,控制刺入深度為5mm,由纖維環(huán)前外側(cè)方平行終板方向刺入椎間盤中央,刺入并維持5s后拔出穿刺針。C組:用22G針頭在L3、4、L4、5、L5、6椎間盤進(jìn)行穿刺,方法同上,刺入后將空針活塞由0mL抽拉至2mL處保持15s,然后拔出穿刺針并逐層縫合創(chuàng)口。D組:以頭端呈45°斜面的針頭套筒為保護(hù)裝置,控制穿刺角度(45°)和刺入深度(10mm),用18G針頭分別在L3、L4和L5椎體中份,沿與椎體呈45°斜向下方刺入,穿破L3、4、L4、5、L5、6椎間盤的上位軟骨終板,旋轉(zhuǎn)2圈后拔出穿刺針。E組:為假手術(shù)組,暴露椎間盤后逐層縫合創(chuàng)口。所有動(dòng)物分別于術(shù)前和手術(shù)結(jié)束時(shí)肌肉注射慶大霉素8萬U,術(shù)后置于標(biāo)準(zhǔn)條件下自由喂養(yǎng)。1.3測(cè)試指標(biāo)1.3.1腰椎正常組織mri掃描及分級(jí)分別于術(shù)后2、4、8、16、32周每組各隨機(jī)選取1只兔,行脊柱CR及MRI檢查。注意保持動(dòng)物麻醉深度相同。MRI檢查:采用SonataMaestroClass1.5T超導(dǎo)MRI掃描儀(Siemens公司,德國(guó)),對(duì)動(dòng)物腰椎行矢狀位T2WI掃描,用SE序列掃描參數(shù)為TR/TE3000/92ms,層厚1.5mm,間隔0mm;選擇經(jīng)兔腰椎正中矢狀面的MRI掃描圖像,以Pfirrmann改良分級(jí)法作為評(píng)估標(biāo)準(zhǔn),記錄各椎間盤分級(jí)的分值。CR檢查:掃描參數(shù)為50kV,100mA,50ms;根據(jù)Kim等提出的“三中線法”,測(cè)得各手術(shù)節(jié)段(L3、4、L4、5、L5、6)椎間盤高度值為X,相鄰健康節(jié)段(L2、3)的椎間盤高度值為Y,各手術(shù)節(jié)段椎間盤的相對(duì)高度H以X與Y的比值來表示。所有影像資料由放射科醫(yī)師行單盲評(píng)估。1.3.2髓核組織水含量測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)各組行影像學(xué)檢測(cè)后,經(jīng)耳緣靜脈注入空氣10mL處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,獲取手術(shù)節(jié)段椎間盤髓核組織,—70℃下凍存?zhèn)溆?進(jìn)行以下檢測(cè)。水含量測(cè)定:采用真空凍干法測(cè)定髓核組織水含量。首先測(cè)量髓核組織濕重,再用GAMMA2-16LSC型真空凍干機(jī)(MartinChrist公司,德國(guó))將樣品在真空缸內(nèi)冷凍干燥12h后稱重(干重)。水含量以占髓核組織樣品濕重的百分比表示,計(jì)算公式:(濕重-干重)/濕重×100%。s-GAG含量測(cè)定:采用DMMB分光光度法測(cè)定髓核組織中s-GAG的含量,以其占髓核組織樣品干重的百分比表示,計(jì)算公式:s-GAG含量/髓核組織干重×100%。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用方差分析,兩兩比較采用SNK檢驗(yàn),P值<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1組患者膝關(guān)節(jié)間隙狹窄程度的比較表1兔腰椎CR片顯示各組術(shù)后2周椎間隙高度基本正常。C、D組在術(shù)后4周,A、B組在術(shù)后8周時(shí),均開始出現(xiàn)明顯的椎間隙降低、終板下骨質(zhì)硬化;隨時(shí)間延長(zhǎng),A~D組椎間隙狹窄程度均不斷加重,上下軟骨終板有不同程度鈣化,椎體前緣可見骨贅形成(圖1)。各時(shí)間點(diǎn)E組無明顯改變。椎間盤相對(duì)高度結(jié)果顯示,D組從術(shù)后2周,A、B、C組從術(shù)后4周開始與E組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);A、B組間各時(shí)間點(diǎn)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);見圖2。2.2各組小鼠髓核信號(hào)強(qiáng)度在觀察期的變化兔腰椎MRIT2WI檢查顯示,A~D組的手術(shù)節(jié)段椎間盤髓核信號(hào)強(qiáng)度在術(shù)后呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì),而各非手術(shù)節(jié)段和E組的髓核信號(hào)強(qiáng)度在觀察期內(nèi)無明顯變化。各組椎間盤分級(jí)分值的變化顯示,C、D組從術(shù)后2周開始,A、B組從術(shù)后4周開始與E組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);A、B組間各時(shí)間點(diǎn)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);見圖3。2.3各組各時(shí)間點(diǎn)間比較術(shù)后A~D組髓核組織水含量隨時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸降低趨勢(shì),見表1。C、D組從術(shù)后2周開始,A、B組從術(shù)后4周開始與E組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A、B組間僅在術(shù)后32周時(shí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A、B、D組術(shù)后8周內(nèi)組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),8周后變化不明顯(P>0.05);C組術(shù)后16周內(nèi)組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),16周后變化不明顯(P>0.05)。2.4各時(shí)間點(diǎn)的比較術(shù)后A~D組髓核組織s-GAG含量隨時(shí)間延長(zhǎng)均呈逐漸降低趨勢(shì),見表2。D組從術(shù)后2周,C組從術(shù)后4周,A、B組從術(shù)后8周開始與E組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);A、B組間各時(shí)間點(diǎn)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。A組s-GAG含量從術(shù)后8周開始顯著下降,與術(shù)后2、4周比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),8周后變化趨于穩(wěn)定(P>0.05);B、C組在整個(gè)觀察期均呈緩慢、穩(wěn)定的下降趨勢(shì),組內(nèi)相鄰兩時(shí)間點(diǎn)間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);D組在術(shù)后8周內(nèi)下降最明顯,相鄰兩時(shí)間點(diǎn)間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),8周后變化趨于緩慢(P>0.05)。3討論3.1普通頭皮穿刺纖維環(huán)自Lob(1933)首次制成羊椎間盤退變模型后,不同方法和不同物種的退變模型相繼建立。早期的手術(shù)直接損傷模型多采用纖維環(huán)切開等方式,通過損傷椎間盤纖維環(huán)達(dá)到誘發(fā)椎間盤退變的目的。但該方法不易控制損傷程度,容易造成髓核組織的急性疝出,所誘導(dǎo)的椎間盤退變過程往往周期短、進(jìn)展快,且可重復(fù)性差。隨后該方法被學(xué)者們逐漸加以改進(jìn),近年來Masuda等提出了使用普通針頭穿刺纖維環(huán)的方法,克服了上述缺點(diǎn),并通過研究證實(shí)其具有操作簡(jiǎn)便、實(shí)驗(yàn)周期短、成功率高等優(yōu)點(diǎn),是目前應(yīng)用較為普遍的椎間盤退變模型。對(duì)于建模物種的選擇從理論上說,因猴是雙足站立的靈長(zhǎng)類動(dòng)物,其身體構(gòu)造、脊柱生物力學(xué)環(huán)境與人類相似度最高,是最為理想的選擇,但其數(shù)量稀少、飼養(yǎng)困難、價(jià)格昂貴,故極少采用。與此類似,豬、犬等大型哺乳動(dòng)物也因條件限制而難以大量應(yīng)用于DDD的相關(guān)研究中。目前仍多以兔和鼠作為構(gòu)建椎間盤退變模型的常規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。本研究選擇新西蘭大白兔作為模型動(dòng)物,具有經(jīng)濟(jì)、便利的特點(diǎn),相對(duì)大鼠而言具有更易于獲取椎間盤及分離髓核組織、更能耐受手術(shù)創(chuàng)傷等優(yōu)點(diǎn),是用于構(gòu)建椎間盤退變模型較為實(shí)用、可行的動(dòng)物。3.2手術(shù)方式的責(zé)任分析模型椎間盤退變是一個(gè)進(jìn)行性改變的過程,在人群中發(fā)生率極高,DDD引發(fā)的腰腿痛降低了生活質(zhì)量,并由此增加大量的醫(yī)療費(fèi)用支出。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)椎間盤的退變過程進(jìn)行了大量研究,但目前對(duì)其機(jī)制尚不完全清楚。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為椎間盤退變是由老齡化、遺傳易感性、生物力學(xué)環(huán)境及椎間盤營(yíng)養(yǎng)等多種因素共同作用的結(jié)果,其組織學(xué)和分子生物學(xué)基礎(chǔ)為椎間盤內(nèi)活性細(xì)胞的減少和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)成分的變性、丟失。髓核內(nèi)的主要ECM成分為Ⅱ型膠原和蛋白多糖,后者主要為s-GAG。Ⅱ型膠原能承受較高的壓應(yīng)力,而s-GAG可結(jié)合水分,對(duì)維持椎間盤黏彈性有重要作用。以上ECM成分丟失、變性會(huì)導(dǎo)致椎間盤內(nèi)水分含量下降,生物力學(xué)性能改變,黏彈性下降,進(jìn)而在反復(fù)的應(yīng)力作用下碎裂、塌陷、變扁。本研究中,A~D組的生化指標(biāo)和影像學(xué)檢查結(jié)果均顯示,損傷后的椎間盤內(nèi)s-GAG和水含量均隨時(shí)間延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì),同時(shí)伴有椎間隙高度和椎間盤MRI信號(hào)的進(jìn)行性改變,以及軟骨下骨質(zhì)的硬化。上述改變趨勢(shì)與一般椎間盤退變過程類似,表明不同的手術(shù)損傷方式均能達(dá)到成功建立椎間盤退變模型的目的。我們發(fā)現(xiàn)不同手術(shù)直接損傷退變模型分別具有以下特征:(1)纖維環(huán)穿刺法誘發(fā)的椎間盤退變過程出現(xiàn)相對(duì)較晚,多在造模手術(shù)后4~8周才開始出現(xiàn)相應(yīng)的影像學(xué)改變和水、s-GAG含量的明顯變化,其進(jìn)展速度較為緩慢;退變程度與穿刺針頭大小有一定相關(guān)性,這一結(jié)果與Masuda等和Sobajima等的研究結(jié)果相似。(2)終板破壞和髓核抽吸法誘發(fā)的椎間盤退變過程出現(xiàn)相對(duì)較早,進(jìn)展較快,且退變程度較重。雖然本研究中3種方法都是通過損傷來誘發(fā)椎間盤退變,但其具體機(jī)制不完全相同。有研究顯示損傷后椎間盤出現(xiàn)退變的機(jī)制可能與炎性反應(yīng)有關(guān)。由于正常椎間盤髓核處于軟骨終板和纖維環(huán)的密封之中,在個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育過程中未接觸機(jī)體免疫系統(tǒng),因此無法獲得天然免疫耐受。當(dāng)椎間盤外層纖維環(huán)破損后,髓核組織接觸到免疫細(xì)胞,引發(fā)自身免疫反應(yīng),導(dǎo)致髓核細(xì)胞發(fā)生凋亡,ECM得不到細(xì)胞分泌補(bǔ)充而變性丟失,最終導(dǎo)致退變。還有研究認(rèn)為,椎間盤破損會(huì)導(dǎo)致其內(nèi)生物力學(xué)環(huán)境發(fā)生改變,改變后的力學(xué)環(huán)境不利于髓核細(xì)胞生存,最終誘發(fā)退變。因此,理論上任何能夠直達(dá)髓核的損傷均可導(dǎo)致椎間盤退變。髓核抽吸的方法除了上述機(jī)制外,其抽吸過程還會(huì)直接使椎間盤丟失部分髓核細(xì)胞和ECM成分,從而進(jìn)一步加速退變進(jìn)