藥物分析 第五章體內(nèi)藥物分析

第五章體內(nèi)藥物分析PharmaceuticalAnalysisinBiologaicalSamples2體內(nèi)藥物分析：體內(nèi)樣品中藥物及其代謝物或內(nèi)源性生物活性物質(zhì)的定量分析。

建立在臨床藥理學(xué)(Clinicalpharmacology)、生物藥劑學(xué)(Biopharmacy)和現(xiàn)代藥物分析學(xué)(Modernpharmaceuticalanalysis)基礎(chǔ)上的新型學(xué)科。1、掌握體內(nèi)藥物分析的特點和應(yīng)用，體內(nèi)樣品分析的前處理、體內(nèi)樣品分析方法驗證的內(nèi)容2、熟悉體內(nèi)樣品的采集與制備方法、體內(nèi)樣品分析方法驗證的技術(shù)要求3、了解體內(nèi)藥物分析的重要性質(zhì)與意義【大綱要求】個體差異體內(nèi)濃度差異療效不同4化學(xué)等價而生物學(xué)不等價

藥理作用強(qiáng)度與作用部位的濃度直接相關(guān)療效吸收分布代謝5血液尿液唾液臟器活性代謝物內(nèi)源性活性物質(zhì)去除蛋白綴合物水解化學(xué)衍生化分離濃集體內(nèi)6

質(zhì)量評價藥物研究臨床應(yīng)用方法藥代動力學(xué)毒代動力學(xué)對象人試驗動物7任務(wù)：方法學(xué)研究為新藥研究提供基本數(shù)據(jù)為治療藥物監(jiān)測（TherapeuticDrugMonitoring，TDM）提供數(shù)據(jù)。內(nèi)源性物質(zhì)的測定和研究濫用藥物的檢測8體內(nèi)樣品特點采樣量少，不易再獲得待測物濃度低干擾物質(zhì)多9◆采樣量少◆待測物濃度低◆干擾物質(zhì)多◆需前處理◆方法靈敏度及專屬性要求高◆工作量大◆色譜分析法◆免疫分析法◆生物學(xué)方法10SomeanalyticaltechniquesGasChromatography/GC-MSHPLC/HPLC-MS/MS/ChiralHPLCHPLC-TOF-MSRadioimmunoassayRIAEnzymeimmunoassayEIA11一、體內(nèi)樣品的種類血樣：藥物濃度與治療作用的關(guān)系。尿樣：用于藥物劑量回收、尿清除率唾液：代替血漿游離濃度進(jìn)行臨床監(jiān)測，藥物動力學(xué)研究。組織：藥物在臟器的分布情況頭發(fā)：體內(nèi)微量元素、用藥史、毒性藥物監(jiān)測第一節(jié)常用體內(nèi)樣品的制備與貯藏

二、體內(nèi)樣品的采集與制備血樣：血樣采集

（靜脈采血）血漿的制備血清的制備12靜脈血置含抗凝劑試管1000×g離心5-10min淡黃色上清液靜脈血置試管放置30-60min1000×g離心5-10min淡黃色上清液（二）尿樣特點濃度高，收集量大，易受飲食、排汗干擾采集自然排尿，隨時尿、晨尿、白天（夜晚）尿以及時間尿貯藏加入適當(dāng)防腐劑13唾液一些藥物唾液濃度與血漿游離濃度密切相關(guān)組成：水、鹽、蛋白質(zhì)采集：漱口后15min3000r/min離心10min取上清組織制備處理1415三、體內(nèi)樣品的貯存與處理冷藏和冷凍：血漿和血清需要在采血以后及時分離，一般最遲不超過2小時長期冷凍（-20℃或-80~-70℃）去活性：采樣后立即終止酶的活性。例：班布特羅（毒扁豆堿）第二節(jié)、體內(nèi)樣品分析的前處理分析測定分離改性濃集1617一、預(yù)處理的目的使待測藥物游離滿足測定方法的要求改善分析環(huán)境18二、常用體內(nèi)樣品預(yù)處理方法19去蛋白分離、濃集綴合物水解衍生化其他（一）去除蛋白質(zhì)溶劑解法常用溶劑乙腈、甲醇體積比：1：2～390％去除方法：超速離心（15000g/min）5min202、加入中性鹽常用中性鹽：飽和硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鹽、枸櫞酸鹽比例：1：290％去除方法：超速離心（15000g/min）213、加入強(qiáng)酸常用溶劑10％三氯醋酸、6％高氯酸、硫酸－鎢酸混合液、5％偏磷酸體積比：1：0.690％去除方法：超速離心（15000g/min）22示例：注射用頭孢他啶-舒巴坦鈉(2:1)

人體藥代動力學(xué)試驗臨床研究精密取血漿樣品0.2mL于置1.5mLEP試管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液（頭孢氨芐，1mg/mL）20μL，渦旋混勻，準(zhǔn)確加入6%高氯酸水溶液0.6毫升，漩渦振蕩1.5分鐘，14000以上離心速度（離心力不小于15000克）離心5分鐘，取上層0.6毫升至預(yù)先加入0.06毫升保護(hù)劑的進(jìn)樣瓶中，搖晃10秒使其均勻，進(jìn)樣20μL，記錄頭孢他啶及內(nèi)標(biāo)峰面積，內(nèi)標(biāo)法計算頭孢他啶的濃度2324ABAB圖1空白血漿加舒巴坦色譜圖圖2空白血漿加入頭孢他啶和頭孢氨芐的色譜圖（A）頭孢他啶

（B）頭孢氨芐

圖3受試者給予1.5g頭孢他啶-舒巴坦（2:1）受試制劑30min時血漿色譜圖(A)頭孢他啶

(B)頭孢氨芐（二）分離、純化與濃集液－液提取法（LLE）大多數(shù)藥物都是脂溶性的，內(nèi)源性物質(zhì)基本上都是水溶性的，當(dāng)用有機(jī)溶劑萃取時，藥物被萃取出來而內(nèi)源性物質(zhì)被除去，因此采用有機(jī)溶劑萃取法能夠達(dá)到純化的目的。25關(guān)鍵要考慮三個方面的因素有機(jī)溶劑的特性有機(jī)溶劑相和水相的體積水相的pH值26溶劑選擇原則：27（1）要求對分子型藥物易溶，離子型藥物不溶（2）沸點低、易揮發(fā)和濃縮（3）要與水不相溶（4）不易乳化（5）具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和惰性（6）不影響檢測溶劑的選擇282、有機(jī)相和水相的體積：一般為1:1～1:23、水相的pH值：堿性藥物→pH>pKa+1～2

酸性藥物→pH＜pKa+1～24、提取次數(shù)：往往進(jìn)行的是一次萃取，個別情況下可以對分離出的含藥有機(jī)相用一定的pH水進(jìn)行反萃?。˙ackextraction)29優(yōu)點：選擇性；藥物能與多數(shù)內(nèi)源性物質(zhì)分離缺點：乳化、有毒、不環(huán)保、不自動

對極性大的化合物的萃取效率低總的流程圖：血漿或其他生物樣品加入萃取溶劑分取有機(jī)層必要時調(diào)pH值減壓氮氣吹干流動相溶解后進(jìn)樣分析示例：鹽酸曲美他嗪緩釋片生物等效性研究精密量取血漿樣品200μl，置2mlEP管中，精密加入甲醇-水（1：1）溶液20μl，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液（200.0000ng/ml丁咯地爾）20μl，加入堿化試劑（1mol/LNaOH溶液）50μl，渦旋混合30秒，加入提取溶劑甲基叔丁基醚2ml，渦旋混合1分鐘，離心（14000rpm）5分鐘，分取上層有機(jī)相，于40℃水浴中空氣流吹干，殘留物加流動相200μl，渦旋混合1分鐘，離心（14000rpm）3分鐘，取上清液180μl進(jìn)樣分析。3031圖1-3空白血漿色譜圖Ⅱ圖1-4待測物曲美他嗪（10.0000ng/ml）與內(nèi)標(biāo)物丁咯地爾（20.0000ng/ml）的血漿樣品色譜圖

322、固相萃取(Solidphaseextraction,SPE)（1）原理根據(jù)液相萃取的原理，利用液相中溶質(zhì)與吸附劑間的選擇性吸附與洗脫原理。當(dāng)液相流經(jīng)吸附劑后，一些小分子藥物被吸附，經(jīng)適當(dāng)洗滌除去雜質(zhì)，再用少量溶劑洗脫，可達(dá)到分離、純化目的。決定因素：藥物與固定相表面的活性基團(tuán)、藥物與溶劑分子間的分子間作用力33洗脫方式：（1）藥物與固定相的親和力>雜質(zhì)與固定相的親和力－先被保留后解吸（2）藥物與固定相的親和力<雜質(zhì)與固定相的親和力－直接洗脫34

可棄性柱、操作步驟少、使用溶劑少、節(jié)省實驗費用和時間35（2）SPE方法建立－以親脂性鍵合硅膠為例1、以甲醇潤濕小柱，活化填料，甲醇含量8％2、用水或緩沖液沖洗小柱，洗去多余的甲醇3、上樣，棄去廢液4、用水或緩沖液沖洗小柱除去水溶性雜質(zhì)5、用合適的洗脫劑洗脫小柱，收集洗脫物6、回收溶劑后進(jìn)行分析和監(jiān)測36實驗中的注意事項1、體液樣品可直接上柱，上樣體積在0.1～2.0ml2、洗脫流速在1～2ml/min3、萃取介質(zhì)中含有少量的甲醇可以提高萃取率4、萃取堿性藥物時，常需在洗脫機(jī)中加酸、有機(jī)胺、醋酸銨或離子對試劑5、選用苯基和氰基柱時，需用極性溶劑如丙酮洗脫6、選用反相硅膠柱時，少量的甲醇和乙腈即可完成洗脫37SPE方法的優(yōu)點：1、引入的雜質(zhì)少2、可以完全避免乳化的形成3、有較高的萃取回收率，重現(xiàn)性好4、小柱可棄，沒有污染5、需要的樣品量少6、洗脫溶劑多為水溶性的，易于實現(xiàn)自動化38SPE的缺點：1、價格昂貴2、技術(shù)要求高3、小柱各批之間有差異4、主子容易堵塞，影響分離效果39一、分析方法的建立分析方法的選擇色譜分析法、免疫分析法、生物學(xué)分析法分析方法建立色譜條件的篩選色譜條件的優(yōu)化實際樣品的測試第三節(jié)、體內(nèi)樣品分析方法與方法驗證401、生物樣品量少2、濃度低3、內(nèi)源性物質(zhì)的干擾4、生物的個體差異較大二、分析方法的驗證41

用于實際生物樣品分析之前： 需要驗證

(validation)分析方法的可行性與可靠性 方法驗證時應(yīng)考慮影響分析方法的所有可變因素：采樣、樣品制備、色譜分離、檢測與數(shù)據(jù)評價 使用的技術(shù)指標(biāo)

—效能指標(biāo) 使用的樣品

—通常采用模擬生物樣品和用藥后的實際生物樣品42驗證步驟

首先為分析方法的驗證

—特異性、精密度與準(zhǔn)確度、回收率、定量限與檢測限、溶液穩(wěn)定性 其次為生物基質(zhì)中待測藥物穩(wěn)定性的驗證

—室溫放置、冷凍（或冷藏）、凍-融循環(huán)

Freeze-and-thawcycle43驗證的效能指標(biāo)與基本要求

1．特異性—避免干擾

2．標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍—覆蓋所有濃度范圍

3．定量下限—達(dá)到峰濃度的1/10～1/20

4．精密度與準(zhǔn)確度—結(jié)果可重現(xiàn)與實際狀況相符

5．穩(wěn)定性—確保所有樣品準(zhǔn)確測定

6．提取回收率—確保準(zhǔn)確度7．分析方法的質(zhì)量控制8.未知生物樣品濃度超出定量范圍的處理44（一）、方法特異性

方法的特異性(specificity)

—又稱專屬性或?qū)Ｒ恍?，通常與選擇性(selectivity)互用

—系指當(dāng)有內(nèi)源性物質(zhì)存在時，方法準(zhǔn)確測定待測物質(zhì)的能力

專屬性—表示所檢測的信號(響應(yīng))系屬于待測藥物所特有 選擇性—系指將待測物質(zhì)與其代謝物及同服的其它藥物加以區(qū)分(分離)的能力

特異性—函蓋二者，以驗證所測定的物質(zhì)與待測藥物的同一性 考察一個分析方法是否具有特異性，應(yīng)著重考慮以下幾點：451.內(nèi)源性物質(zhì)的干擾

比較—待測藥物或其活性代謝產(chǎn)物檢測信號 對照品（或標(biāo)準(zhǔn)品） 空白生物基質(zhì) 模擬生物樣品（空白生物基質(zhì)中添加對照品）

—如HPLC色譜峰的tR、n和T是否一致 及與內(nèi)源性物質(zhì)色譜峰的R

確證—內(nèi)源性物質(zhì)對分析方法有無干擾462.代謝產(chǎn)物的干擾

比較模擬生物樣品和用藥后的實際生物樣品的檢測信號與代謝產(chǎn)物的R

如HPLC色譜峰的tR、n和T〔或改變色譜條件(色譜柱)再比較〕來確證其它代謝產(chǎn)物對分析方法有無干擾

473.聯(lián)合藥物的干擾

TDM時

—還要考慮患者可能同時服用藥物的干擾 通過比較待測藥物及可能同時服用藥物的模擬生物樣品的檢測信號 如HPLC色譜峰的tR、n和T是否一致

來確證同時服用藥物對分析方法的干擾情況48精密量取4名受試者空白血漿200μl，置2mlEP管中，精密加入乙腈40μl，按“血漿樣品處理方法”項下自“加入堿化試劑（1mol/LNaOH溶液）50μl”起同法試驗。得色譜圖1-3；精密量取空白血漿200μl，置2mlEP管中，精密加入曲美他嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液（102.4000ng/ml）20μl和內(nèi)標(biāo)溶液（200.0000ng/ml丁咯地爾）20μl，按“血漿樣品處理方法”項下自“加入堿化試劑（1mol/LNaOH溶液）50μl”起同法試驗，得色譜圖1-4；精密量取受試者13單次口服受試制劑0.75小時后的血漿樣品200μl，置2mlEP管中，按“血漿樣品處理方法”同法試驗，得色譜圖1-5。上述色譜圖結(jié)果表明曲美他嗪的保留時間為3.16分鐘左右，丁咯地爾的保留時間為1.96分鐘左右，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾曲美他嗪和內(nèi)標(biāo)物丁咯地爾的測定（Ⅰ為曲美他嗪，Ⅱ為丁咯地爾）。4950二、標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍標(biāo)準(zhǔn)曲線（standardcurve）—calibrationcurveorworkingcurve

—生物樣品中所測定藥物濃度與響應(yīng)的相關(guān)性（比例的程度）

—通常用回歸分析方法所得的回歸方程來評價

—除少數(shù)方法（免疫分析法）外，標(biāo)準(zhǔn)曲線通常為線性模式

—回歸分析法為最小二乘法（leastsquares）或加權(quán)最小二乘法（weightedleastsquares） 線性范圍（linearrang）—標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高與最低濃度的區(qū)間

—模擬生物樣品的測定結(jié)果應(yīng)達(dá)到試驗要求的精密度和準(zhǔn)確度51（二）、標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

標(biāo)準(zhǔn)曲線—用模擬生物樣品建立—范圍(不包括零點)應(yīng)覆蓋全部生物樣品中的藥物濃度—不能使用外推的方法求算未知生物樣品中的藥物濃度

建立標(biāo)準(zhǔn)曲線所使用的模擬生物樣品應(yīng)使用與待測的含藥生物樣品相同的生物基質(zhì)制備52標(biāo)準(zhǔn)曲線的一般建立方法標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的制備內(nèi)標(biāo)溶液的制備標(biāo)準(zhǔn)系列模擬生物樣品的制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制加權(quán)最小二乘法限度要求53標(biāo)準(zhǔn)曲線的一般建立方法

1.標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的制備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)－對照品、標(biāo)準(zhǔn)品 溶劑—水或甲醇（或其他適當(dāng)溶劑） 濃度—模擬生物樣品中藥物濃度的50倍以上 加入量為生物樣品總體積的2%以下 避免標(biāo)準(zhǔn)模擬生物樣品與實際樣品存在較大差異 濃度較低—應(yīng)除去溶劑后再加入生物基質(zhì) 否則,在實際樣品測定時應(yīng)加入等體積的溶劑并渦旋混勻54

至少含5～8個濃度點(不包括零點,即空白) —可覆蓋全部待測生物樣品中的藥物濃度 如：1、2、5、10、20、50、100(等比梯度模式—比例常數(shù)約為2)

若體內(nèi)平均達(dá)峰濃度為50，其1/20為2.5

設(shè)定最高濃度為100，最低濃度為1(個體差異)552、內(nèi)標(biāo)溶液的制備內(nèi)標(biāo)物質(zhì)－對照品、標(biāo)準(zhǔn)品或化學(xué)試劑適宜的溶劑－甲醇、水、乙腈或混合溶劑濃度－與標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的中間濃度相當(dāng)如：某標(biāo)準(zhǔn)溶液5、10、20、40、80、160、320μg/ml，則內(nèi)標(biāo)的濃度應(yīng)配制成40μg/ml563.標(biāo)準(zhǔn)系列模擬生物樣品的制備

空白生物基質(zhì)(如血漿)—加入標(biāo)準(zhǔn)系列溶液適量，渦旋混勻 為防止在標(biāo)準(zhǔn)溶液加入及渦旋混合時造成的損失

——①先加入標(biāo)準(zhǔn)溶液

②再加入空白生物基質(zhì) ③渦旋混勻①②③574.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以待測藥物的檢測響應(yīng)(如色譜峰面積或峰高)或與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的檢測響應(yīng)的比值(內(nèi)標(biāo)法)(因變量,y)對模擬血藥濃度(自變量,x)

—求得回歸方程(y＝a＋bx)及其相關(guān)系數(shù)(

)

在一組由至少7個濃度(不包括零點)構(gòu)成的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，至多可有2個濃度點數(shù)據(jù)，可予剔除。但應(yīng)有確切原因，如：（1）樣品處理有損失；（2）色譜圖有問題；（3）顯著偏離標(biāo)準(zhǔn)曲線

—其余應(yīng)有至少5個濃度點在標(biāo)準(zhǔn)曲線上58加權(quán)最小二乘法

普通最小二乘法—每個濃度點絕對誤差(yi－yi’)賦予同等的重要性

標(biāo)準(zhǔn)曲線上的高低濃度相差懸殊(范圍達(dá)102)

—低濃度區(qū)的計算值相對誤差過大，難以滿足規(guī)定要求。加權(quán)最小二乘法—回歸計算時增加一個權(quán)重因子(w)

—各濃度的響應(yīng)值與回歸值的相對離差平方和達(dá)到最小式中，wi為標(biāo)準(zhǔn)曲線上第i個濃度點的權(quán)重因子592）權(quán)重因子的選擇

加權(quán)—賦予低濃度點以更大的權(quán)重 在實際工作中的一般方法 （1）當(dāng)wi=1/(yi’)2時，則 （2）而yi與xi成正比 （3）所以，令wi=1/(bxi)2=k/xi2(通常取wi=1/C2)

當(dāng)高濃度點測量值的準(zhǔn)確度下降過大 低濃度點權(quán)重過大，降低低濃度點的權(quán)重，wi=k/xi60標(biāo)準(zhǔn)曲線的限度要求

藥代動力學(xué)或生物利用度研究

—標(biāo)準(zhǔn)曲線至少包括5個濃度(通常為5～8個濃度,不包括零點)

—最高濃度應(yīng)高于達(dá)峰濃度(Cmax)；最低濃度應(yīng)低于Cmax的10%～5%，并應(yīng)為方法的LOQ(非LOD)

—回歸方程的截距應(yīng)接近于零，b≥使之具有較高的靈敏度

—相關(guān)系數(shù)要求

≥0.99(色譜法)或≥0.98(生物學(xué)方法)

—若非線性，可分為高低兩個濃度區(qū)間(每個區(qū)間不少于5個濃度)，分別加權(quán)回歸—如1、2、5、10、20和10、20、50、100、20061精密量取空白血漿200μl，置2mlEP管中，分別精密加入不同濃度曲美他嗪標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各20μl，配制成血漿中曲美他嗪濃度為0.5000，1.0000，2.5000，10.0000，50.0000，100.0000，200.0000ng/ml的血漿樣品，按“血漿樣品處理方法”項下自“精密加入內(nèi)標(biāo)溶液（200.0000ng/ml丁咯地爾）20μl”起同法試驗，每一濃度進(jìn)行雙樣本分析，制備曲美他嗪的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以待測物濃度與內(nèi)標(biāo)物濃度比值為橫坐標(biāo)X，待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值（As/Ai）為縱坐標(biāo)Y，用加權(quán)最小二乘法[3]（權(quán)重系數(shù)：W=1/X2）進(jìn)行線性回歸運算，求得的線性回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。結(jié)果表明，曲美他嗪在0.5000～180.0000ng/ml范圍內(nèi)待測物和內(nèi)標(biāo)物峰面積之比線性關(guān)系良好，濃度測定結(jié)果均達(dá)到試驗要求的精密度與準(zhǔn)確度[1]。6263（三）、定量限

方法定量限(limitofquantitation，LOQ) —系指在保證具有一定可靠性(準(zhǔn)確度與精密度符合要求)的前提下，能測定出生物樣品中藥物的最低濃度,又稱為方法靈敏度(sensitivity) —標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點

64同一生物介質(zhì)，5個獨立的標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度大于（S/N）＝5。1、測定法65LODTestS/N＝566要求—應(yīng)能滿足測定3～5個消除半衰期后生物樣品中的藥物濃度或Cmax的10％～5％) —準(zhǔn)確度在80%～120%(或RE在±20%的范圍內(nèi)) —RSD≤20%2、限度要求67（四）、精密度與準(zhǔn)確度

方法精密度(precision) —系指確定的分析條件下相同生物介質(zhì)中相同濃度樣品的

一系列測量值的分散程度，QC的RSD

—包括批內(nèi)和批間RSD —反映分析方法的可操作性，是方法驗證的基本要點之一 —使用模擬生物樣品測定68

方法準(zhǔn)確度(accuracy) —系指用該方法測得的生物樣品中待測藥物的濃度與其真實濃度的接近程度

—應(yīng)使用實際生物樣品測定，但實際生物樣品的濃度是未知的所以，通常使用模擬生物樣品測定

—一般用相對回收率(relativerecovery，RR)或相對誤差(relativeerror，RE)表示691.測定法

高、中、低3個濃度的QC，每一濃度n=5，連續(xù)3個分析批 批間RSD=

批內(nèi)RSD= =70

計算

—測定值M(measured)的平均值與理論濃度(加入值)A(added)比值 相對回收率 相對誤差 限度要求

—相對回收率應(yīng)在85%～115%(LOQ附近80%～120%) —RE在±15%(LOQ附近為±20%)71（五）、穩(wěn)定性在生物樣品的分析中，需要對樣品的存放條件和時間進(jìn)行考察，以保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠方法穩(wěn)定性考察生物樣品的穩(wěn)定性考察相關(guān)穩(wěn)定性的測定方法與要求72生物樣品的穩(wěn)定性短期穩(wěn)定性主要考察模擬生物樣品在室溫、4℃或－20℃以及凍－融循環(huán)條件下的穩(wěn)定性長期穩(wěn)定性主要考察生物樣品長期冰凍（－20℃或－80℃）后的穩(wěn)定性73測定方法與要求1、取高、中、低三個濃度的QC樣品，在不同條件下存放不同時間后，每個樣品重復(fù)測定三次