尖吻蛇血凝酶止血作用的實(shí)驗(yàn)研究

尖吻蛇血凝酶止血作用的實(shí)驗(yàn)研究

作為一種動(dòng)物來源的凝血酶，其毒性低、見效快、長期有效性和無血管破裂等優(yōu)點(diǎn)近年來引起了人們的廣泛關(guān)注。自1936年奧地利著名毒蛇學(xué)家Klobusitzky和Konig首次從巴西矛頭腹蛇(Bothropsatrox)毒液中獲得部分純化的巴曲酶(Batroxobin,商品名立止血)以來,迄今已發(fā)現(xiàn)30余種蛇毒類凝血酶。尖吻蝮蛇血凝酶(HaemocoagulaseAgkistrodon,HCA,商品名蘇靈)是一種從尖吻蝮蛇毒液中提取分離出的蛇毒類凝血酶,該類凝血酶具有良好的止血作用,而且不良反應(yīng)輕,耐受性好,作為一個(gè)止血藥物,它已經(jīng)完成臨床前和臨床試驗(yàn)。2009年3月,康辰醫(yī)藥股份有限公司將HCA作為國家一類創(chuàng)新藥物申報(bào)上市銷售,商品名“蘇靈”。本文通過一系列的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究,進(jìn)一步確證HCA的藥效并初步研究其作用機(jī)制。材料表面1注射用血凝酶、血漿受試藥物:注射用尖吻蝮蛇血凝酶(HCA,商品名蘇靈,康辰醫(yī)藥股份有限公司,批號(hào):20090611,規(guī)格:1U·瓶-1);注射用血凝酶(商品名立止血,瑞士素高藥廠,規(guī)格:1.0KU·瓶-1,批號(hào):810309)。其他試劑:人凝血酶(Sigma公司,批號(hào):087K7570,規(guī)格:200U·瓶-1);標(biāo)準(zhǔn)人血漿(來源于南方醫(yī)院);人纖維蛋白原(Sigma公司,批號(hào):108K7535,規(guī)格:250mg·瓶-1);脲(廣東光華化學(xué)廠有限公司,批號(hào):20090223,規(guī)格:500g·瓶-1)。2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及儀器SPF級(jí)SD大鼠30只(6周齡),雌雄各半,體重220～260g,由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):SCXK粵2006-0015。3儀器與設(shè)備Agilent1200系列高效液相色譜系統(tǒng)、AgilentC18色譜柱(150mm×4.6mm,5μm)均購自安捷倫科技有限公司;AlphaHP3400熒光/可見數(shù)字圖像分析系統(tǒng)(美國AlphaHP3400公司);BIORAD電泳儀(北京賽百奧科技有限公司);Eppendorf5415小型高速離心機(jī)(上海肯強(qiáng)儀器有限公司);THZC1型冷凍恒溫?fù)u床(太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠);BS124S型分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。方法1血凝塊的溶解分別取0.05mol·L-1Tris-HCl(pH7.4)緩沖液、1U·mL-1HCA、1KU·mL-1立止血、2U·mL-1凝血酶各0.5mL,與0.5mL標(biāo)準(zhǔn)人血漿混合,于37℃水浴鍋中孵育。待血凝塊形成30min后,用濾紙吸干水分,稱量血凝塊重量,然后將凝塊置于5mL5mol·L-1尿素中,靜置18h。觀察并記錄血凝塊的溶解情況,稱量血凝塊溶解后重量,計(jì)算溶解率:溶解率/%=(溶前血栓濕重-溶后血栓濕重)/溶前血栓濕重×100%。另用0.05mol·L-1Tris-HCl(pH7.4)緩沖液配制10mg·mL-1人纖維蛋白原溶液(Fib溶液)代替標(biāo)準(zhǔn)人血漿,重復(fù)上述試驗(yàn)。2給藥、血栓形成法SD大鼠30只,體重220～260g,雌雄各半,隨機(jī)分成3組:HCA組、立止血組和溶媒對(duì)照組。各組按3U·kg-1劑量水平尾靜脈注射相應(yīng)藥物,溶媒對(duì)照組給予等量溶媒。給藥后腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠,仰臥固定于手術(shù)臺(tái),于腹中線縱向切開皮膚約3cm,從腹白線處打開腹腔,鈍性分離下腔靜脈,于左腎靜脈下方用4號(hào)縫合線結(jié)扎下腔靜脈,同時(shí)結(jié)扎下方兩條主要分支靜脈,縫合腹壁。3h后,重新打開腹腔,在結(jié)扎處下方約2cm處用4號(hào)縫合線結(jié)扎,將該段管腔內(nèi)血液吸盡,縱行剪開,觀察有無血栓形成,如有則取出血栓稱濕重,然后將血栓置于5mL5mol·L-1尿素溶液中,靜置18h。觀察并記錄血栓的溶解情況,稱量溶解后的血栓濕重,計(jì)算溶解率。3高效液相色譜分析用0.05mol·L-1Tris-HCl(pH7.4)緩沖液分別配制10mg·mL-1人纖維蛋白原溶液、4U·mL-1HCA溶液和8U·mL-1人凝血酶溶液。每次取纖維蛋白原溶液和HCA溶液各0.5mL加入4支1.5mLEP管中,于37℃水浴鍋分別孵育10,30,60和120min。另取纖維蛋白原溶液、凝血酶溶液各0.5mL加入1.5mLEP管中,37℃孵育120min。水浴結(jié)束后沸水煮3～5min,以終止反應(yīng),產(chǎn)物經(jīng)13000r·min-1離心10min,取上清液,進(jìn)行高效液相色譜分析。HPLC條件如下:實(shí)驗(yàn)儀器:安捷倫科技1200系列高效液相色譜系統(tǒng);流動(dòng)相:A相為含0.05mol·L-1三乙胺的0.1mol·L-1磷酸(pH3.0),B相為色譜甲醇,用前以0.2μm微孔濾膜過濾并脫氣,用時(shí)兩相比例為61∶39;其他:AgilentC18色譜柱(150mm×4.6mm,5μm),流速為1mL·min-1,壓力為155～159bar,室溫為20～22℃,檢測(cè)波長210nm,上樣量為100μL。4樣品溶液的制備用0.05mol·L-1Tris-HCl(pH7.4)緩沖液分別配制10mg·mL-1人纖維蛋白原溶液和4U·mL-1HCA溶液。每次取纖維蛋白原溶液、HCA溶液各0.25mL,加入6支1.5mLEP管中,于37℃水浴鍋分別孵育10min,30min,1h,2h,4h和12h。水浴結(jié)束后每個(gè)反應(yīng)體系中加入5mol·L-1尿素0.5mL。待纖維蛋白凝塊溶解后,將樣品與SDS上樣緩沖液4∶1混合,沸水煮3～5min,取15μL小心上樣。接通電泳儀電源,在積層膠階段用低電壓(40V)使樣品濃縮成一條線,然后加大電壓(80V),約2.5h后待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)切斷電源,小心取出凝膠,切角標(biāo)記,新鮮配制考馬斯亮藍(lán)染色10min,脫色液洗凈凝膠背景,然后用AlphaHP3400熒光/可見數(shù)字圖像分析系統(tǒng)觀察記錄電泳結(jié)果。5組患者療效比較采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理數(shù)據(jù),結(jié)果以xˉ±sxˉ±s表示,組間差異的比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1hca不激活因子各試驗(yàn)組體外形成凝塊實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1和表2。HCA組凝塊大小與立止血組相似,表明其凝血效果相當(dāng)。在不含凝血因子ⅩⅢ的Fib溶液中,HCA,立止血和凝血酶作用下形成的凝塊均可全部溶解,而在含有凝血因子ⅩⅢ的標(biāo)準(zhǔn)人血漿中,HCA作用下形成的凝塊同樣可以完全溶解,其他的則不能,由此說明HCA不激活ⅩⅢ因子。其中,HCA作用下形成的凝塊能在較短的時(shí)間內(nèi)(≤5min)完全溶解,其他陽性對(duì)照藥作用下形成的凝塊則不能完全溶解或溶解緩慢。2血栓在5mol-1尿素溶液中的溶解情況各試驗(yàn)組體內(nèi)形成血栓大小結(jié)果見表3。HCA組血栓重量遠(yuǎn)大于溶媒對(duì)照組(P<0.01);與立止血組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。此外,HCA組血栓在5mol·L-1尿素溶液中的溶解率遠(yuǎn)大于其他組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。但由于內(nèi)源性凝血途徑未能得到抑制,導(dǎo)致血栓不能完全溶解。3ab2和28.108.10.8.10.10.10.10%a肽片段的保留時(shí)間為8.10min.由HPLC圖譜可知(見圖1和圖2),HCA與人纖維蛋白原(AαBβγ)2作用時(shí),僅釋放其中的A肽片段,其保留時(shí)間為8.8min;而凝血酶與人纖維蛋白原作用時(shí),同時(shí)釋放A和B肽片段,其保留時(shí)間分別為8.7和18.5min。4hca降解人纖維素原肽鏈中的亞基由圖3可知,HCA與纖維蛋白原共同孵育12h后α亞基帶基本消失,這說明HCA能夠降解人纖維蛋白原肽鏈中的α亞基。同時(shí),凝膠中出現(xiàn)了其他一些條帶,這可能是反應(yīng)過程中裂解產(chǎn)生的一些新的肽片段。hca凝血酶原的作用機(jī)制人體內(nèi)正常的血液凝固過程是一系列酶促反應(yīng)形成的,包括內(nèi)源性和外源性兩種凝血途徑,但最后均在凝血酶的作用下,切除纖維蛋白原(AαBβγ)2肽鏈上的A肽和B肽形成纖維蛋白單體(αβγ)2而凝血。凝血酶另一個(gè)重要作用就是切除凝血因子XⅢ的部分肽段,從而激活因子XⅢ使其形成活化態(tài)的XⅢa,催化γ鏈C端上的谷氨酞胺殘基與鄰近γ鏈上的賴氨酸殘基共價(jià)結(jié)合,使纖維蛋白產(chǎn)生共價(jià)交聯(lián),形成不易溶解的纖維蛋白絡(luò)合物。本研究中,在體、離體實(shí)驗(yàn)均確證了HCA的止血效果及作用機(jī)制。離體實(shí)驗(yàn)中,在有凝血因子ⅩⅢ存在的條件下,HCA作用下形成的凝塊也能很好溶解,這表明HCA不激活凝血酶原復(fù)合物及XШ因子,適用于血管內(nèi)給藥而又不至于引起血管內(nèi)栓塞、彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)等并發(fā)癥;在體內(nèi)試驗(yàn)中,可能由于內(nèi)源性凝血途徑未能得到抑制,導(dǎo)致凝血因子ⅩⅢ被激活,形成了不易被溶解纖維蛋白絡(luò)合物,導(dǎo)致HCA作用下形成的血栓不能完全溶解。纖維蛋白原是由三對(duì)多肽鏈組成的球棒狀分子,其結(jié)構(gòu)式為(AαBβγ)2,α及β鏈的N端分別有一段16個(gè)和14個(gè)氨基酸組成的小肽,稱為纖維肽A(FpA)及B(FpB)。凝血酶的作用就是切除這兩個(gè)肽段,切除FpA、FpB后纖維蛋白原就轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白單體。在切除FpA、FpB后,纖維蛋白原的結(jié)合位點(diǎn)被暴露出來,同時(shí)由于去除了FpA和FpB上所帶大量負(fù)電荷的排斥作用,使纖維蛋白單體之間可以共價(jià)結(jié)合,其宏觀表現(xiàn)就是Fib溶液的凝固。HCA作為一種蛇毒類凝血酶,它僅裂解出纖維蛋白原的A肽片段,使其形成纖維蛋白單體(αBβγ)2,并以非共價(jià)交聯(lián)的形式聚合成易溶的纖維蛋白多聚體,從而發(fā)揮止血作用。與其他傳