尖吻蛇血凝酶止血作用的實驗研究

尖吻蛇血凝酶止血作用的實驗研究

作為一種動物來源的凝血酶，其毒性低、見效快、長期有效性和無血管破裂等優(yōu)點近年來引起了人們的廣泛關注。自1936年奧地利著名毒蛇學家Klobusitzky和Konig首次從巴西矛頭腹蛇(Bothropsatrox)毒液中獲得部分純化的巴曲酶(Batroxobin,商品名立止血)以來,迄今已發(fā)現(xiàn)30余種蛇毒類凝血酶。尖吻蝮蛇血凝酶(HaemocoagulaseAgkistrodon,HCA,商品名蘇靈)是一種從尖吻蝮蛇毒液中提取分離出的蛇毒類凝血酶,該類凝血酶具有良好的止血作用,而且不良反應輕,耐受性好,作為一個止血藥物,它已經(jīng)完成臨床前和臨床試驗。2009年3月,康辰醫(yī)藥股份有限公司將HCA作為國家一類創(chuàng)新藥物申報上市銷售,商品名“蘇靈”。本文通過一系列的體內外實驗研究,進一步確證HCA的藥效并初步研究其作用機制。材料表面1注射用血凝酶、血漿受試藥物:注射用尖吻蝮蛇血凝酶(HCA,商品名蘇靈,康辰醫(yī)藥股份有限公司,批號:20090611,規(guī)格:1U·瓶-1);注射用血凝酶(商品名立止血,瑞士素高藥廠,規(guī)格:1.0KU·瓶-1,批號:810309)。其他試劑:人凝血酶(Sigma公司,批號:087K7570,規(guī)格:200U·瓶-1);標準人血漿(來源于南方醫(yī)院);人纖維蛋白原(Sigma公司,批號:108K7535,規(guī)格:250mg·瓶-1);脲(廣東光華化學廠有限公司,批號:20090223,規(guī)格:500g·瓶-1)。2實驗動物及儀器SPF級SD大鼠30只(6周齡),雌雄各半,體重220～260g,由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供,合格證號:SCXK粵2006-0015。3儀器與設備Agilent1200系列高效液相色譜系統(tǒng)、AgilentC18色譜柱(150mm×4.6mm,5μm)均購自安捷倫科技有限公司;AlphaHP3400熒光/可見數(shù)字圖像分析系統(tǒng)(美國AlphaHP3400公司);BIORAD電泳儀(北京賽百奧科技有限公司);Eppendorf5415小型高速離心機(上?？蠌妰x器有限公司);THZC1型冷凍恒溫搖床(太倉市實驗設備廠);BS124S型分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。方法1血凝塊的溶解分別取0.05mol·L-1Tris-HCl(pH7.4)緩沖液、1U·mL-1HCA、1KU·mL-1立止血、2U·mL-1凝血酶各0.5mL,與0.5mL標準人血漿混合,于37℃水浴鍋中孵育。待血凝塊形成30min后,用濾紙吸干水分,稱量血凝塊重量,然后將凝塊置于5mL5mol·L-1尿素中,靜置18h。觀察并記錄血凝塊的溶解情況,稱量血凝塊溶解后重量,計算溶解率:溶解率/%=(溶前血栓濕重-溶后血栓濕重)/溶前血栓濕重×100%。另用0.05mol·L-1Tris-HCl(pH7.4)緩沖液配制10mg·mL-1人纖維蛋白原溶液(Fib溶液)代替標準人血漿,重復上述試驗。2給藥、血栓形成法SD大鼠30只,體重220～260g,雌雄各半,隨機分成3組:HCA組、立止血組和溶媒對照組。各組按3U·kg-1劑量水平尾靜脈注射相應藥物,溶媒對照組給予等量溶媒。給藥后腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠,仰臥固定于手術臺,于腹中線縱向切開皮膚約3cm,從腹白線處打開腹腔,鈍性分離下腔靜脈,于左腎靜脈下方用4號縫合線結扎下腔靜脈,同時結扎下方兩條主要分支靜脈,縫合腹壁。3h后,重新打開腹腔,在結扎處下方約2cm處用4號縫合線結扎,將該段管腔內血液吸盡,縱行剪開,觀察有無血栓形成,如有則取出血栓稱濕重,然后將血栓置于5mL5mol·L-1尿素溶液中,靜置18h。觀察并記錄血栓的溶解情況,稱量溶解后的血栓濕重,計算溶解率。3高效液相色譜分析用0.05mol·L-1Tris-HCl(pH7.4)緩沖液分別配制10mg·mL-1人纖維蛋白原溶液、4U·mL-1HCA溶液和8U·mL-1人凝血酶溶液。每次取纖維蛋白原溶液和HCA溶液各0.5mL加入4支1.5mLEP管中,于37℃水浴鍋分別孵育10,30,60和120min。另取纖維蛋白原溶液、凝血酶溶液各0.5mL加入1.5mLEP管中,37℃孵育120min。水浴結束后沸水煮3～5min,以終止反應,產(chǎn)物經(jīng)13000r·min-1離心10min,取上清液,進行高效液相色譜分析。HPLC條件如下:實驗儀器:安捷倫科技1200系列高效液相色譜系統(tǒng);流動相:A相為含0.05mol·L-1三乙胺的0.1mol·L-1磷酸(pH3.0),B相為色譜甲醇,用前以0.2μm微孔濾膜過濾并脫氣,用時兩相比例為61∶39;其他:AgilentC18色譜柱(150mm×4.6mm,5μm),流速為1mL·min-1,壓力為155～159bar,室溫為20～22℃,檢測波長210nm,上樣量為100μL。4樣品溶液的制備用0.05mol·L-1Tris-HCl(pH7.4)緩沖液分別配制10mg·mL-1人纖維蛋白原溶液和4U·mL-1HCA溶液。每次取纖維蛋白原溶液、HCA溶液各0.25mL,加入6支1.5mLEP管中,于37℃水浴鍋分別孵育10min,30min,1h,2h,4h和12h。水浴結束后每個反應體系中加入5mol·L-1尿素0.5mL。待纖維蛋白凝塊溶解后,將樣品與SDS上樣緩沖液4∶1混合,沸水煮3～5min,取15μL小心上樣。接通電泳儀電源,在積層膠階段用低電壓(40V)使樣品濃縮成一條線,然后加大電壓(80V),約2.5h后待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時切斷電源,小心取出凝膠,切角標記,新鮮配制考馬斯亮藍染色10min,脫色液洗凈凝膠背景,然后用AlphaHP3400熒光/可見數(shù)字圖像分析系統(tǒng)觀察記錄電泳結果。5組患者療效比較采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件處理數(shù)據(jù),結果以xˉ±sxˉ±s表示,組間差異的比較采用t檢驗。P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。結果1hca不激活因子各試驗組體外形成凝塊實驗結果見表1和表2。HCA組凝塊大小與立止血組相似,表明其凝血效果相當。在不含凝血因子ⅩⅢ的Fib溶液中,HCA,立止血和凝血酶作用下形成的凝塊均可全部溶解,而在含有凝血因子ⅩⅢ的標準人血漿中,HCA作用下形成的凝塊同樣可以完全溶解,其他的則不能,由此說明HCA不激活ⅩⅢ因子。其中,HCA作用下形成的凝塊能在較短的時間內(≤5min)完全溶解,其他陽性對照藥作用下形成的凝塊則不能完全溶解或溶解緩慢。2血栓在5mol-1尿素溶液中的溶解情況各試驗組體內形成血栓大小結果見表3。HCA組血栓重量遠大于溶媒對照組(P<0.01);與立止血組相比,差異無統(tǒng)計學顯著性。此外,HCA組血栓在5mol·L-1尿素溶液中的溶解率遠大于其他組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。但由于內源性凝血途徑未能得到抑制,導致血栓不能完全溶解。3ab2和28.108.10.8.10.10.10.10%a肽片段的保留時間為8.10min.由HPLC圖譜可知(見圖1和圖2),HCA與人纖維蛋白原(AαBβγ)2作用時,僅釋放其中的A肽片段,其保留時間為8.8min;而凝血酶與人纖維蛋白原作用時,同時釋放A和B肽片段,其保留時間分別為8.7和18.5min。4hca降解人纖維素原肽鏈中的亞基由圖3可知,HCA與纖維蛋白原共同孵育12h后α亞基帶基本消失,這說明HCA能夠降解人纖維蛋白原肽鏈中的α亞基。同時,凝膠中出現(xiàn)了其他一些條帶,這可能是反應過程中裂解產(chǎn)生的一些新的肽片段。hca凝血酶原的作用機制人體內正常的血液凝固過程是一系列酶促反應形成的,包括內源性和外源性兩種凝血途徑,但最后均在凝血酶的作用下,切除纖維蛋白原(AαBβγ)2肽鏈上的A肽和B肽形成纖維蛋白單體(αβγ)2而凝血。凝血酶另一個重要作用就是切除凝血因子XⅢ的部分肽段,從而激活因子XⅢ使其形成活化態(tài)的XⅢa,催化γ鏈C端上的谷氨酞胺殘基與鄰近γ鏈上的賴氨酸殘基共價結合,使纖維蛋白產(chǎn)生共價交聯(lián),形成不易溶解的纖維蛋白絡合物。本研究中,在體、離體實驗均確證了HCA的止血效果及作用機制。離體實驗中,在有凝血因子ⅩⅢ存在的條件下,HCA作用下形成的凝塊也能很好溶解,這表明HCA不激活凝血酶原復合物及XШ因子,適用于血管內給藥而又不至于引起血管內栓塞、彌散性血管內凝血(DIC)等并發(fā)癥;在體內試驗中,可能由于內源性凝血途徑未能得到抑制,導致凝血因子ⅩⅢ被激活,形成了不易被溶解纖維蛋白絡合物,導致HCA作用下形成的血栓不能完全溶解。纖維蛋白原是由三對多肽鏈組成的球棒狀分子,其結構式為(AαBβγ)2,α及β鏈的N端分別有一段16個和14個氨基酸組成的小肽,稱為纖維肽A(FpA)及B(FpB)。凝血酶的作用就是切除這兩個肽段,切除FpA、FpB后纖維蛋白原就轉變?yōu)槔w維蛋白單體。在切除FpA、FpB后,纖維蛋白原的結合位點被暴露出來,同時由于去除了FpA和FpB上所帶大量負電荷的排斥作用,使纖維蛋白單體之間可以共價結合,其宏觀表現(xiàn)就是Fib溶液的凝固。HCA作為一種蛇毒類凝血酶,它僅裂解出纖維蛋白原的A肽片段,使其形成纖維蛋白單體(αBβγ)2,并以非共價交聯(lián)的形式聚合成易溶的纖維蛋白多聚體,從而發(fā)揮止血作用。與其他傳