橘葉黃酮類成分的分離鑒定及薄層色譜鑒別研究

橘葉黃酮類成分的分離鑒定及薄層色譜鑒別研究

橙色葉是廣州植物的橙色葉及其種植變體。性平、苦、辛。具有平肝健脾、散粘液、結(jié)果化等功效。橘葉應(yīng)用歷史悠久,《本草綱目》、《本草從新》等書中都有記載;現(xiàn)代“乳塊消片”等成藥中也應(yīng)用了橘葉。橘葉主要含有揮發(fā)油、碳水化合物、黃酮類等成分,有關(guān)橘葉質(zhì)量控制方面研究?jī)H見橙皮苷含量測(cè)定的報(bào)道。為了完善橘葉藥材的質(zhì)量控制研究,為進(jìn)一步制定其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù),本研究進(jìn)行了橘葉黃酮類成分研究與薄層色譜鑒別,現(xiàn)報(bào)道如下。1儀器和試劑盒1.1超聲-質(zhì)譜分析系統(tǒng)BrukerAVANCEAV400型超導(dǎo)脈沖傅里葉變換核磁共振譜儀[瑞士Bruker公司,溶劑為氘代二甲亞砜-D6(DMSO-d6)],ZY-600U薄層色譜自動(dòng)成像分析系統(tǒng)(北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司),LK-400藥用粉碎機(jī)(浙江城關(guān)紅利數(shù)控制造廠),BP211D型電子分析天平(德國(guó)Sartorius公司),KQ-500型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。1.2橘葉的生長(zhǎng)和來源柱層析硅膠(200-300目)和硅膠G-254薄層板均由青島海洋化工廠分廠生產(chǎn),環(huán)己烷、乙酸乙酯、硫酸、乙醇等試劑均為分析純。橘葉樣品共5批,采自不同產(chǎn)地,經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院林勵(lì)研究員鑒定,其原植物均為橘CitrusreticulataBlanco。采樣信息詳見表1。2方法和結(jié)果2.1環(huán)己烷乙酸乙酯的制備取藥材2kg,加8倍量乙醇回流提取3次,每次1.5h,濾過,合并濾液,減壓回收乙醇,得總浸膏180g。浸膏加入適量水分散,用乙酸乙酯萃取至無色,萃取液減壓濃縮得到乙酸乙酯部分浸膏。粗提物乙酸乙酯部分進(jìn)行反復(fù)硅膠柱層析,洗脫劑為環(huán)己烷∶乙酸乙酯(體積比100∶1～1∶100);分離得到化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。2.2化合物乙酸乙酯化合物Ⅰ:黃色針晶(乙酸乙酯),熔點(diǎn)(mp)141℃～142℃。氫核磁共振(1H-NMR)(DMSO-d6,400MHz)化學(xué)位移值(δ):12.71(5-OH),7.07(1H,s,H-3),7.71(1H,dd,J=8.64,2.12Hz,H-6′),7.59(1H,d,J=2.12Hz,H-2′),7.18(1H,d,J=8.64Hz,H-5′);碳核磁共振(13C-NMR)(DMSO-d6,100MHz)δ:163.61(C-2),103.57(C-3),182.61(C-4),145.22(C-5),135.81(C-6),152.34(C-7),132.57(C-8),148.48(C-9),106.20(C-10),122.75(C-1′),109.28(C-2′),149.02(C-3′),152.48(C-4′),111.87(C-5′),119.99(C-6′),61.77(6-C),61.43(7-C),60.50(8-C),55.74(3′-C),55.70(4′-C)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中5-去甲川陳皮素一致,故鑒定化合物Ⅰ為5-去甲川陳皮素(5-demethyl-nobiletin),分子式為C20H20O8,分子量為388?；衔铫?白色針晶(乙酸乙酯),mp153℃～154℃。1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:6.75(1H,s,H-3),8.00(2H,d,J=9.00Hz,H-2′,H-6′),7.14(2H,d,J=9.00Hz,H-3′,H-5′),4.03(3H,s,OCH3),3.97(3H,s,OCH3),3.86(3H,s,OCH3),3.84(3H,s,OCH3),3.79(3H,s,OCH3);13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:161.95(C-2),106.02(C-3),175.67(C-4),143.51(C-5),150.87(C-6),137.68(C-7),147.46(C-8),147.07(C-9),114.62(C-10),123.04(C-1′),127.70(C-2′,C-6′),114.25(C-3′,C-5′),160.30(C-4′),61.83(5-C),61.78(6-C),61.44(7-C),61.32(8-C),55.46(4′-C)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中橘紅素一致,故鑒定化合物Ⅱ?yàn)殚偌t素(tangeretin),分子式為C20H20O7,分子量為372。化合物Ⅲ:白色針晶(乙酸乙酯),mp134℃～135℃。1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:6.85(1H,s,H-3),7.65(1H,dd,J=8.60,2.12Hz,H-6′),7.55(1H,d,J=2.12Hz,H-2′),7.16(1H,d,J=8.60Hz,H-5′),4.03(3H,s,OCH3),3.98(3H,s,OCH3),3.88(3H,s,OCH3),3.86(3H,s,OCH3),3.85(3H,s,OCH3),3.79(3H,s,OCH3);13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:160.22(C-2),106.27(C-3),175.75(C-4),143.47(C-5),148.99(C-6),137.61(C-7),147.46(C-8),147.10(C-9),108.94(C-10),123.12(C-1′),111.85(C-2′),151.74(C-3′),150.88(C-4′),114.23(C-5′),119.29(C-6′),61.82(5-C),61.74(6-C),61.44(7-C),61.34(8-C),55.68(3′-C),55.65(4′-C)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中川陳皮素一致,故鑒定化合物Ⅲ為川陳皮素(nobiletin)。分子式為C21H22O8,分子量為402?；衔铫?白色針晶(乙酸乙酯),mp175℃～176℃。1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:6.80(1H,s,H-3),7.66(1H,dd,J=8.60,2.12Hz,H-6′),7.55(1H,d,J=2.12Hz,H-2′),7.12(1H,d,J=8.60Hz,H-5′),7.22(1H,s,H-6);13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:160.24(C-2),106.36(C-3),175.62(C-4),151.65(C-5),97.29(C-6),157.36(C-7),139.71(C-8),153.88(C-9),112.00(C-10),123.13(C-1′),109.20(C-2′),148.99(C-3′),151.51(C-4′),111.66(C-5′),119.41(C-6′),61.77(5-C),60.92(7-C),56.41(8-C),55.86(3′-C),55.66(4′-C)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中異橙黃酮一致,故鑒定化合物Ⅳ為異橙黃酮(isosinensetin),分子式為C20H20O7,分子量為372。2.3高效液相色譜法取橘葉藥材粉末1.0g,置錐形瓶中,加入乙醇40mL,超聲提取30min,冷卻,濾過,濾液水浴蒸干,加甲醇5mL使溶解,作為供試品溶液。另取川陳皮素、5-去甲川陳皮素、橘紅素、異橙黃酮對(duì)照品各1mg,加甲醇分別制成1mg/mL的溶液,作為對(duì)照品溶液。照中國(guó)藥典附錄ⅥB中薄層色譜法試驗(yàn),吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各5μL,分別點(diǎn)于同一硅膠GF-254薄層板上,以環(huán)己烷—乙酸乙酯(體積比為5∶5)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(254nm)下檢視,再噴以體積分?jǐn)?shù)10%硫酸乙醇溶液,在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰,置日光下檢視。供試品色譜中,在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn)(見圖1)。圖1結(jié)果顯示:橘葉藥材與對(duì)照品5-去甲川陳皮素、橘紅素、川陳皮素、異橙黃酮在相同的位置顯示相同顏色的特征斑點(diǎn),顯色前4個(gè)斑點(diǎn)于紫外燈254nm下均顯暗斑點(diǎn),以體積分?jǐn)?shù)10%硫酸乙醇溶液顯色后,日光下皆顯亮黃色。整張色譜圖斑點(diǎn)清晰,色譜行為良好。3橘葉質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的建立川陳皮素、5-去甲川陳皮素、橘紅素及異橙黃酮4種黃酮類成分系首次從橘葉中分離得到。本試驗(yàn)所建立的橘葉薄層鑒別方法薄層行為良好,適用于橘葉的鑒別。橘葉暫未錄入《中華人民共和國(guó)藥典》,關(guān)于其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定,目前尚屬空白,本研究?jī)?nèi)容為橘葉質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了科學(xué)的參考依據(jù)。橘葉為蕓香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培變種的葉,廣東地區(qū)民間栽培的橘習(xí)稱有十月橘、清明橘、馬水橘等多個(gè)種類,筆者