實(shí)驗(yàn)三 血清γ-球蛋白的分離、純化及鑒定(七年制)

血清γ球蛋白的

分離純化與鑒定劉曉如1【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?．學(xué)習(xí)鹽析法、凝膠層析和離子交換層析分離純化蛋白質(zhì)的基本原理及應(yīng)用2．掌握醋酸纖維薄膜電泳技術(shù)的原理及應(yīng)用3．了解蛋白質(zhì)分離純化的總體思路2

【實(shí)驗(yàn)方法】

一、鹽析法粗分γ-球蛋白二、凝膠過(guò)濾方法脫鹽三、離子交換層析方法純化γ-球蛋白四、醋酸纖維素薄膜電泳法鑒定γ-球蛋白的純度

3【基本原理】

蛋白質(zhì)的分離、純化及鑒定是研究蛋白質(zhì)化學(xué)性質(zhì)及生物學(xué)功能的重要手段之一。不同蛋白質(zhì)的分子量、溶解度及在一定條件下，帶電的情況等都有所不同。利用這些性質(zhì)的差別，可分離純化各種蛋白質(zhì)。4分離蛋白質(zhì)的方法分離方法沉淀法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法層析法電學(xué)法電泳法等電聚焦超速離心法離子交換層析吸附層析凝膠過(guò)濾（分子篩）親和層析在分離純化時(shí)，根據(jù)情況選用幾種方法，相互配合才能達(dá)到分離純化一種蛋白質(zhì)的目的。5【基本原理】

本實(shí)驗(yàn)采用硫酸銨鹽析、葡聚糖凝膠過(guò)濾、離子交換層析方法，分離純化血清γ-球蛋白。最后用醋酸纖維素薄膜電泳法鑒定γ-球蛋白的純度。

6實(shí)驗(yàn)思路分段鹽析去除雜蛋白凝膠層析脫鹽交聯(lián)葡聚糖吸水濃縮醋酸纖維素薄膜電泳鑒定先粗后細(xì)離子交換層析純化7一、鹽析法粗分離血清γ-球蛋白

鹽析法是根據(jù)不同蛋白質(zhì)在不同濃度的中性鹽溶液中溶解度不同，分別析出，達(dá)到彼此分離的方法。本實(shí)驗(yàn)在半飽和硫酸銨溶液中，清蛋白溶解，球蛋白將沉淀析出，經(jīng)離心所得的沉淀即為球蛋白的粗提液。8定義：加入大量中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的穩(wěn)定因素并使從溶液中沉淀析出的現(xiàn)象。原理:

破壞蛋白質(zhì)兩個(gè)穩(wěn)定因素：

水化膜和電荷層中性鹽：(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。優(yōu)點(diǎn)：蛋白質(zhì)不變性，常用。鹽析法9鹽析步驟取離心管一支加入血清2ml加入2ml0.9%氯化鈉搖勻邊攪拌混勻邊緩慢滴加飽和(NH4)2SO44ml上清液（主要含清蛋白）傾去靜置10min，再離心（5000轉(zhuǎn)/分）10min沉淀用1ml0.9%氯化鈉攪拌溶解逐滴加飽和(NH4)2SO42ml,搖勻靜置10min，再離心（5000轉(zhuǎn)/分）10min傾棄上清液（主要含α、β球蛋白）沉淀即為初步純化的γ－球蛋白加入0.0175mol/L磷酸緩沖液（pH=6.3)1ml溶解γ－球蛋白粗提液10二、葡聚糖凝膠柱層析脫鹽

欲去除鹽析法分離得到的球蛋白粗提液中大量鹽，通常有兩種方法：

凝膠層析法、透析本試驗(yàn)采用葡聚糖凝膠——SephadexG25層析方法除去球蛋白粗提液中的鹽硫酸銨，以便下一步用離子交換層析方法進(jìn)一步提純球蛋白。11凝膠層析原理：P31

凝膠層析法是按混合物各組分分子量大小不同隨流動(dòng)相經(jīng)過(guò)層析柱的時(shí)間不同而被分離的技術(shù)。

凝膠是一類具有三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的干燥顆粒，當(dāng)吸收一定量溶液后溶漲成柔軟、富有彈性、不帶電荷、不與溶質(zhì)相互作用的惰性物質(zhì)，凝膠層析以其為固定相。層析時(shí)，直徑大于凝膠網(wǎng)孔的大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部，只能沿著凝膠顆粒間的間隙隨流動(dòng)相向下移動(dòng)，所以流程短、流速快，首先流出層析柱；而小分子物質(zhì)直徑小于凝膠網(wǎng)孔能自由出入，洗脫時(shí)間長(zhǎng)，后流出層析柱，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間層析，分子大小不同的物質(zhì)彼此分開，達(dá)到分離的目的。

12凝膠層析法脫鹽13凝膠柱層析脫鹽14分子篩層析15數(shù)學(xué)模型VoViVtVi—凝膠孔內(nèi)水（內(nèi)水）Vo—顆粒間水（外水）Vg—凝膠體積總體積Vt=Vi+Vo+Vg16Kd

—分配系數(shù)：精確衡量混合物中某一待分離成分在凝膠柱內(nèi)的洗脫行為，反映物質(zhì)分子進(jìn)入凝膠顆粒的程度，是溶質(zhì)分子大小的一個(gè)函數(shù)Ve—洗脫體積：分離物被洗脫時(shí)所用的洗脫液體積Kd=(Ve-Vo)/Vi

洗脫曲線：以洗脫體積為橫坐標(biāo)，各物質(zhì)濃度/吸光度為縱坐標(biāo)作圖17（1）完全被排阻的極端大分子，Ve=Vo，Kd=0（2）中等分子，Ve=Vo+Kd·Vi，0<Kd<1（3）完全滲透的小分子，Ve=Vo+Vi，Kd=118▲SephadexG-25的準(zhǔn)備▲裝柱（15~20cm）操作步驟：1、層析柱保持垂直。2、放蒸餾水，排出空氣，關(guān)閉出口。3、加入攪拌均勻的SephadexG-25懸液，調(diào)節(jié)流速10滴/min，使凝膠均勻沉降，不斷補(bǔ)充，直至18cm。4、上留1-2mm的水，關(guān)閉出口。

注意：★床面上要保持少許水，防止膠床露出液面。

★膠面不平，用玻棒輕輕攪動(dòng)，讓凝膠自然沉降，使表面平整。19▲加樣與洗脫▲凝膠的再生1、加樣：用滴管將鹽析后樣品加入柱床面，打開出口使樣品溶液滲入凝膠。2、洗脫：加入洗脫液，打開出口，保持流速10滴/min，收集洗脫液，每管收集1ml。用奈氏試劑檢測(cè)NH4+。3、保存：20%璜基水楊酸溶液檢測(cè)洗脫液的蛋白質(zhì)，保存含量高的進(jìn)一步純化

不斷加洗脫液，使NH4+全部流出，為下次實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備20脫鹽

12345678910②上樣γ－球蛋白，粗提液①裝柱葡聚糖凝膠G-25，柱高18-20cm流速：每分鐘10滴左右

③加入洗脫劑④收集20滴換一支試管21⑤.層析后洗脫液檢測(cè)白色比色板,洗凈備用。一塊在各孔滴加奈氏試劑（檢測(cè)NH4+）,另一塊滴加20%璜基水楊酸（檢測(cè)蛋白質(zhì)）。不用滴管,避免污染,直接倒…用“-”表示無(wú)現(xiàn)象，用“+”,“++”,“+++”等表示顏色深淺⑥回收凝膠22注意事項(xiàng)：

1.凝膠柱的制備質(zhì)量決定分離效果的好壞。

2.加樣分離時(shí)，滴速越慢，分離效果越好?！?/p>

以管號(hào)為橫軸，蛋白質(zhì)含量為縱軸繪制洗脫曲線，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。23三、DEAE－纖維素離子交換層析

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

1.通過(guò)使用DEAE－纖維素離子交換層析法，進(jìn)一步純化γ-球蛋白脫鹽液，得到較純的γ-球蛋白溶液

2.學(xué)習(xí)了解離子交換層析方法的基本原理和應(yīng)用24離子交換層析的基本原理

離子交換層析是一種常用的、通過(guò)使用各種類型的離子交換劑達(dá)到分離純化目的的層析方法。離子交換劑是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將帶電基團(tuán)引入到惰性支持物上形成的固體物質(zhì)，在實(shí)驗(yàn)中作為固定相。如果其帶負(fù)電，則能結(jié)合陽(yáng)離子，成為陽(yáng)離子交換劑；如果其帶正電，則能結(jié)合陰離子，稱為陰離子交換劑。可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，選擇不同的離子交換劑進(jìn)行離子交換層析。

DEAE（二乙基氨基乙基）－纖維素含有可離子化的堿基，可與氫離子結(jié)合，成為帶正電荷的陰離子交換劑。25DEAE－纖維素離子交換層析純化γ－球蛋白血清α、β、γ－球蛋白、清蛋白的等電點(diǎn)為：清蛋白pI=4.64，

α2球蛋白

pI=5.06，

β球蛋白pI=5.12，

γ球蛋白pI=7.3本實(shí)驗(yàn)采用0.0175mol/lpH6.5NH4Ac緩沖液進(jìn)行洗脫。此pH，DEAE帶正電荷，可與帶負(fù)電荷的α、β-球蛋白和清蛋白結(jié)合，而帶正電荷的γ-球蛋白不與DEAE結(jié)合，首先從層析柱中洗脫出來(lái)，首先收集到的既是純化的γ-球蛋白。26操作將脫鹽后的球蛋白加于DEAE柱上（方法同凝膠過(guò)濾），用0.0175mol/lpH6.3NH4Ac緩沖液洗脫，流速10滴～15滴/分，用小試管連續(xù)收集流出液（約1.0ml/管），用20%磺基水楊酸溶液檢查蛋白質(zhì)分布情況，收集含量最高的部分，濃縮作純度鑒定。用該緩沖液洗脫下來(lái)的是γ－球蛋白。27１.使用離心機(jī)的操作注意事項(xiàng)。２.裝柱時(shí)檢查是否漏水。３.裝柱后凝膠均一無(wú)斷層，無(wú)氣泡，柱床面平整。４.柱床面保持有緩沖液。５.加樣時(shí)動(dòng)作緩慢輕柔，不要破壞柱床面的平整。６.每用一次滴管，請(qǐng)用水清洗干凈，防止試劑及被測(cè)樣品交叉污染。28四、γ－球蛋白純化液的濃縮

利用葡聚糖凝膠富含羥基，吸水，不允許大分子蛋白進(jìn)入微孔的特性，在樣品溶液