茶氨酸的研究進(jìn)展

茶氨酸的研究進(jìn)展吳琳指導(dǎo)老師：王會(huì)L-茶氨酸（L-Theanine）最早于1950年酒戶彌二郎從日本綠茶中分離得到，是茶葉的特征氨基酸，也是茶葉的主要呈味物質(zhì)之一。茶氨酸含量直接決定茶葉品質(zhì)，與綠茶品質(zhì)的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.787～0.876,對(duì)紅茶與烏龍茶品質(zhì)與風(fēng)味的形成也至關(guān)重要。茶氨酸大量存在于茶樹中，是一種非蛋白質(zhì)游離氨基酸,占干茶總重的1%～2%,占茶樹體內(nèi)游離氨基酸總量的50%以上。迄今為止,僅在茶、茶梅及蕈三種植物中發(fā)現(xiàn)這種特殊氨基酸。近年來，茶氨酸的一些特殊生理功能不斷被發(fā)現(xiàn)，成為茶葉功能成分研究與利用的又一大熱點(diǎn)。茶氨酸的研究進(jìn)展1茶氨酸的理化性質(zhì)2茶氨酸的生理功能3茶氨酸的制備方法4茶氨酸檢測(cè)5茶氨酸的應(yīng)用6發(fā)展前景7致謝1茶氨酸的理化性質(zhì)茶氨酸屬酰胺類化合物，系統(tǒng)命名為N-乙基-γ-L-谷胺酰胺(N-ethyl-γ-L-glatamine)，分子結(jié)構(gòu)為:CH3-CH2-CONH-CH2-CH2-CHNH2-COOH。自然存在的茶氨酸均為L(zhǎng)型，純品為白色針狀晶體，熔點(diǎn)217～218℃(分解)，比旋光度[α]D20=0.7°。茶氨酸極易溶于水(1:216)，在茶湯中泡出率達(dá)80%,不溶于乙醇、乙醚。茶氨酸水溶液呈微酸性,具有焦糖香和類似谷氨酸的鮮爽味,味覺閥值為0.06%，能緩解苦澀味，增加茶湯鮮甜味。茶氨酸經(jīng)25%硫酸或6mol/L鹽酸水解，可分解為L(zhǎng)-谷氨酸和乙胺;與茚三酮反應(yīng)強(qiáng)烈并呈紫色；易與堿或銅生成淡紫色柱狀銅鹽。2茶氨酸的生理功能2.1鎮(zhèn)靜和松弛神經(jīng)作用2.2增強(qiáng)學(xué)習(xí)和記憶功能2.3降血壓作用2.4抗腫瘤作用和提高抗癌藥物的療效2.5保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞的作用2.6減肥作用2.7抗疲勞作用2.8改善經(jīng)期綜合癥2.9護(hù)肝作用2.10提高人體免疫力2.1鎮(zhèn)靜和松弛神經(jīng)作用茶葉中含有興奮作用的咖啡因，但人們飲茶后反而感到輕松、平靜，心情舒暢，現(xiàn)已證實(shí)主要是茶氨酸的鎮(zhèn)靜作用。木村等人研究證明了茶氨酸對(duì)咖啡因產(chǎn)生的興奮有拮抗作用，他測(cè)定了咖啡因引起的中樞神經(jīng)性自發(fā)運(yùn)動(dòng)量，結(jié)果表明咖啡因與茶氨酸同時(shí)攝入時(shí)對(duì)興奮有明顯的抑制作用。最近，有學(xué)者用腦電圖儀評(píng)價(jià)方法進(jìn)一步確定茶氨酸和咖啡因在幾乎相同摩爾濃度的情況下，對(duì)咖啡因的刺激作用產(chǎn)生拮抗。1998年KobayashiK等研究L-茶氨酸對(duì)人腦α波釋放的影響。腦波通常分為四種:δ波熟睡時(shí)出現(xiàn)、θ波打盹時(shí)出現(xiàn)、α波松弛時(shí)出現(xiàn)、β波興奮時(shí)出現(xiàn)。在封閉環(huán)境下,25℃,照度40LX,給試驗(yàn)者分別口服水和茶氨酸的水溶液(50～200mg/ml)1小時(shí)后,測(cè)得服茶氨酸水溶液的實(shí)驗(yàn)者,α波出現(xiàn)量顯著增加。證明L-茶氨酸對(duì)精神放松作用的效果。2.2增強(qiáng)學(xué)習(xí)和記憶功能Terashima等研究發(fā)現(xiàn)茶氨酸使腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺顯著增加，而多巴胺是腎上腺素及去甲腎上腺素的合成前體,是對(duì)傳達(dá)腦神經(jīng)細(xì)胞興奮起重要作用的物質(zhì)。而神經(jīng)傳遞物質(zhì)的變化會(huì)影響學(xué)習(xí)能力、記憶力等。老鼠服用茶氨酸3～4個(gè)月后，學(xué)習(xí)能力提高，能在較短時(shí)間內(nèi)掌握要領(lǐng)，對(duì)危險(xiǎn)環(huán)境的記憶力比對(duì)照強(qiáng)。2.3降血壓作用Yokogoshi等通過實(shí)驗(yàn)證明血壓的調(diào)節(jié)是通過人體中樞及末梢神經(jīng)系統(tǒng)的遞質(zhì)兒茶酚胺和5-羥色胺的分泌量來實(shí)現(xiàn)的。在服用茶氨酸后,5-羥色胺在老鼠大腦中的合成減少了，而且增加了其在老鼠大腦中的分解，老鼠體內(nèi)的5-羥色胺的含量也明顯降低。在給自發(fā)性高血壓老鼠注射不同劑量的茶氨酸時(shí)，血壓呈下降趨勢(shì)，并且下降的程度與注射的劑量呈正比關(guān)系，但茶氨酸的劑量不會(huì)影響正常老鼠的血壓。2.4抗腫瘤作用和提高抗癌藥物的療效茶氨酸是谷氨酰胺的衍生物,二者結(jié)構(gòu)相似，而腫瘤細(xì)胞的谷氨酰胺代謝比正常細(xì)胞活躍得多。因此,茶氨酸作為谷氨酰胺的競(jìng)爭(zhēng)物,通過干擾谷氨酰胺的代謝來抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。SadzukaY等研究了茶氨酸對(duì)阿霉素抗腫瘤活性的影響。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)茶氨酸可抑制阿霉素從埃利希腹水腫瘤細(xì)胞中滲出，并且維持了阿霉素在腫瘤組織內(nèi)的濃度。此外，注射抗癌藥依達(dá)素（idarubicin）能降低白細(xì)胞和骨髓細(xì)胞數(shù)，但當(dāng)與茶氨酸配合使用時(shí)，可緩解依達(dá)素這種毒性，并促進(jìn)依達(dá)素抗腫瘤作用。抗癌藥毒殺素（doxorubicin）與茶氨酸配合應(yīng)用時(shí)，可抑制M5076卵巢內(nèi)瘤向肝臟轉(zhuǎn)移。2.5保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞的作用1995年Nozawa等最早研究發(fā)現(xiàn)的：將體外培養(yǎng)的鼠中樞神經(jīng)細(xì)胞暴露于一定濃度的谷氨酸中出現(xiàn)50%的神經(jīng)細(xì)胞死亡，但若加入茶氨酸則死亡明顯被抑制。以后，Kakuka等在沙土鼠實(shí)驗(yàn)中，使它們處于3min腦缺血狀態(tài)，缺血前分別注入三種不同濃度的茶氨酸溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦神經(jīng)細(xì)胞遲發(fā)性死亡得到明顯保護(hù)，而且存在劑量依賴關(guān)系。Hirookal等也發(fā)現(xiàn)在鼠慢性青光眼模型中，早期大劑量使用茶氨酸或預(yù)處理對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用顯著。茶氨酸是興奮性遞質(zhì)谷氨酸的類似物，對(duì)谷氨酸受體有競(jìng)爭(zhēng)保護(hù)作用，因此，茶氨酸對(duì)腦組織有保護(hù)作用，可避免由腦缺血所致腦神經(jīng)細(xì)胞死亡。2.6減肥作用用混有0.028%茶氨酸的飼料喂養(yǎng)小鼠16周后，其體重比對(duì)照群有明顯減少，腹腔支付減少到對(duì)照群的58%，同時(shí)血液的中性脂肪及膽固醇含量分別減少32%和15%，肝臟中膽固醇減少28%。因此，茶葉的減肥作用是茶葉中包括茶氨酸在內(nèi)的多種成分共同作用的結(jié)果，茶氨酸尤其對(duì)減少體內(nèi)膽固醇有效。2.7抗疲勞作用王小雪等研究證明茶氨酸具有抗疲勞作用。經(jīng)口給予小鼠不同劑量的茶氨酸30天,能明顯延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間,減少肝糖原的消耗量,降低運(yùn)動(dòng)時(shí)血清尿素氮水平；對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)后血乳酸升高有明顯的抑制作用,能促進(jìn)運(yùn)動(dòng)后血乳酸的消除。因此,茶氨酸具有抗疲勞作用。其機(jī)理可能與茶氨酸可抑制5-羥色胺分泌,促進(jìn)兒茶酚胺分泌有關(guān)(5-羥色胺對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有抑制作用,而兒茶酚胺具有興奮作用)。2.8改善經(jīng)期綜合癥經(jīng)期綜合癥（簡(jiǎn)稱PMS）是女性在月經(jīng)前3至10日中出現(xiàn)的精神及身體上的不舒適癥狀。Juneja等考察了茶氨酸對(duì)PMS的改善作用，讓24名女性每日服用茶氨酸200mg，兩個(gè)月后PMS癥狀（頭痛、腰痛、無力、疲憊、煩躁等）有明顯改善。其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。2.9護(hù)肝作用

浙江大學(xué)何普明，用大白鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究，結(jié)果表明，綠茶的肝功能保護(hù)作用最強(qiáng)，把綠茶用各種有機(jī)溶劑提取分離顯示，起抑制作用的有效成分為黃酮醇糖苷、茶氨酸和水溶性多糖。2.10提高人體免疫力參考消息（2003.4.23）轉(zhuǎn)載一條消息，美國(guó)哈佛大學(xué)最近完成的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明，綠茶、烏龍茶與茶制品中含有一類高濃度氨基，能提高人體免疫細(xì)胞的工作能力，增強(qiáng)人體抵抗傳染病的能力。杰克·布科夫斯基在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)L-茶氨酸能使飲茶者體內(nèi)的免疫系統(tǒng)血細(xì)胞對(duì)病菌的反應(yīng)比飲咖啡者快5倍，茶氨酸在肝臟里分解的產(chǎn)物乙胺還能對(duì)付其他病原體，包括寄生蟲、病毒和腫瘤。所以科學(xué)家建議，每天喝5杯茶可遠(yuǎn)離疾病。3茶氨酸的制備方法3.1茶葉中茶氨酸提取與分離法3.2化學(xué)合成法3.3微生物發(fā)酵法3.4組織培養(yǎng)法3.1茶葉中茶氨酸提取與分離法（1）特殊試劑沉淀法：采用某些有機(jī)或無機(jī)試劑與相應(yīng)氨基酸形成不溶性衍生物的一種分離方法。茶氨酸與堿式碳酸銅生成淡紫色柱狀銅鹽，利用此性質(zhì)可將茶氨酸分離。傳統(tǒng)的提取方法是:茶葉熱水浸提→醋酸鉛沉淀去除茶湯中的蛋白質(zhì)、多酚類等→通H2S去除過剩的鉛,氯仿萃取去除咖啡堿→加堿式碳酸銅成鹽→過濾→稀硫酸溶解，加入H2S和適量Ba(OH)2抽濾去濾渣、濃縮、結(jié)晶→天然茶氨酸純品。此法步驟長(zhǎng)、工序較多，收率較低，還引入Pb2+、Cu2+重金屬離子。茶氨酸銅鹽在稀硫酸中溶解度不大，應(yīng)加入大量稀硫酸，還易造成茶氨酸損失，不適合工業(yè)生產(chǎn)。（2）離子交換法離子交換技術(shù)是氨基酸工業(yè)中應(yīng)用最為廣泛的提取方法之一。茶氨酸作為兩性物質(zhì),選擇適當(dāng)?shù)膒H值,用離子交換樹脂可以分離提取。但關(guān)于這方面的報(bào)道很少,僅1998年陳瑛等報(bào)道了用離子交換法提取茶氨酸，他們選用國(guó)產(chǎn)732陽離子交換樹脂,從茶愈傷組織浸提液中提取茶氨酸。通過靜態(tài)、動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn),對(duì)洗脫液的pH、離子強(qiáng)度、樣液濃度和流速等因素進(jìn)行了考察,比較了在不同條件下,樹脂對(duì)茶氨酸的吸附情況。結(jié)果表明茶氨酸的得率為70%。離子交換法操作簡(jiǎn)單，收率高，原料來源充分，價(jià)格低廉，對(duì)環(huán)境最為友好。但由于茶葉中茶氨酸的含量不高,單純地從茶葉中提取茶氨酸成本很高，但從提取茶多酚后的殘留液中再用離子交換樹脂提取茶氨酸,是一項(xiàng)很有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的工藝技術(shù)。而且高效可再生的專用交換樹脂較缺乏。（3）膜分離法膜技術(shù)是一項(xiàng)新興的綠色和節(jié)能技術(shù)。它具有高效、過程基本無相變、可在常溫下進(jìn)行以及工藝簡(jiǎn)單、操作方便、投資省、低污染等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用。蕭力爭(zhēng)等研究報(bào)道了用膜技術(shù)提取和分離茶氨酸，采用截留分子量為3500Da的超濾膜和反滲透膜聯(lián)合來分離與富集兒茶素渣中的茶氨酸，綜合得率可達(dá)54.05%,產(chǎn)品純度達(dá)8.53%，提高了茶葉深度開發(fā)利用的綜合效益，降低了生產(chǎn)成本，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。但單用這一工藝，茶氨酸的得率與純度整體水平仍不高。（4）色譜分離法制備高效液相色譜是一種分離生產(chǎn)技術(shù)，近年來被應(yīng)用到茶氨酸的制備上，可獲得高純度的L-茶氨酸。肖偉濤等通過實(shí)驗(yàn)，采用制備高效液相色譜技術(shù)，對(duì)25%茶葉提取物中茶氨酸進(jìn)行制備、分離純化，所得產(chǎn)品用外標(biāo)法定量純度大于98%，制備收率大于60%。因此該法具有生產(chǎn)周期短、產(chǎn)品質(zhì)量高、方法簡(jiǎn)便、費(fèi)用低，茶氨酸產(chǎn)品可用作分析方法的對(duì)照品等特點(diǎn)。張瑩等報(bào)道了用色譜法制備茶氨酸時(shí)，采用體積超載的方式可以提高茶氨酸的產(chǎn)量；采用較大顆粒的填料可提高制備量。3.2化學(xué)合成法茶氨酸的化學(xué)合成首先是谷氨酸的吡咯烷酮化。1942年，以色列人Lichtenstein首次在實(shí)驗(yàn)室中通過乙胺和吡咯烷酮酸在水溶液中反應(yīng)得到了茶氨酸。此后，日本人改進(jìn)了合成方法，用L-吡咯烷酮酸與純乙胺（不是在水溶液中）來提高茶氨酸產(chǎn)率。1961年Y.Yamda等曾用將L–吡咯烷酮先形成酮鹽,再與純乙胺反應(yīng)的方法合成茶氨酸，大大提高了反應(yīng)的效率。谷氨酸的吡咯烷酮化并非合成茶氨酸的唯一方法。T.Furuyama等于1964年采用二硫化碳保護(hù)α-氨基而合成了茶氨酸。1965年,Lichtenstein改用谷氨酸為原料,用鈀碳催化還原合成茶氨酸。目前茶氨酸的化學(xué)合成法主要是谷氨酸—乙胺合成法:將谷氨酸在室溫下脫水，轉(zhuǎn)化為環(huán)狀內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu),然后控制一定條件,使乙胺與轉(zhuǎn)化成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的谷氨酸結(jié)合形成茶氨酸。采用化學(xué)合成法制備茶氨酸具有價(jià)格低、成本低、適合工業(yè)化的特點(diǎn)。但存在原料不易得、難于提純、有污染和毒性等缺點(diǎn)。而且化學(xué)合成直接得到的茶氨酸都是DL-型消旋體，需要進(jìn)行拆分才能得到L-型產(chǎn)品。而人體需要并能吸收利用的是天然L-型茶氨酸，若攝入過量D型氨基酸會(huì)引起中毒，甚至危及生命?，F(xiàn)采用微生物固定酶法分離DL-型氨基酸取得成功，使該法的卡脖子問題得到解決。

3.3微生物發(fā)酵法近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，利用微生物發(fā)酵來生產(chǎn)酶,再利用酶的提取物來生產(chǎn)茶氨酸的方法被廣泛應(yīng)用。該法與化學(xué)合成法相比有自身特色：無需對(duì)α-氨基進(jìn)行乙胺基化；需與葡萄糖的降解反應(yīng)相偶聯(lián)得到生物合成茶氨酸的能量；不經(jīng)拆分能直接得到L-茶氨酸；無污染。目前應(yīng)用于生產(chǎn)的酶促合成茶氨酸反應(yīng)，實(shí)際上是運(yùn)用細(xì)菌(Pseudomonasnitroreducens)中的谷氨酰胺合成酶提取物在特殊條件下(高乙胺濃度和特定的pH值)進(jìn)行的非特異反應(yīng),該酶在通常情況下對(duì)氨的親和力比乙胺大得多，由此獲得一種大規(guī)模生產(chǎn)的低成本人工合成茶氨酸技術(shù)。之所以未能從茶樹中提取能以更高效率合成茶氨酸的酶,是因?yàn)樵撁柑资Щ?而且在生物體內(nèi)合成需ATP水解成ADP提供能量。最近，日本太陽化學(xué)株式會(huì)社采用微生物酶生物合成L-茶氨酸技術(shù)已申請(qǐng)專利（WO2004/016798）。立木隆等從自然界的土壤中分離、選定的香茅醇假單孢菌GEA是屬于假單孢菌屬香茅種(citronellosis)，具有γ-谷氨?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的茶氨酸生產(chǎn)菌。通過在pH9～12條件下將來自上述生產(chǎn)菌的谷氨酰胺酶用于谷氨酰胺和乙胺混合物，能以與現(xiàn)有方法相比非常高的效率制造茶氨酸。3.4組織培養(yǎng)法就是采用茶樹細(xì)胞培養(yǎng)來產(chǎn)生茶氨酸；或者采用茶樹愈傷組織培養(yǎng)來產(chǎn)生茶氨酸，然