產(chǎn)a-淀粉酶的枯草桿菌的篩選與產(chǎn)酶條件的研究

--10-產(chǎn)а-淀粉酶的枯草桿菌的篩選與產(chǎn)酶條件的爭論引 言枯草芽孢桿菌〔B.S〕屬于芽孢桿菌屬，革蘭氏陽性菌，無莢膜，需氧菌，可利用a-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生產(chǎn)菌。α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶、異淀粉酶和環(huán)糊精生成酶。α-淀粉酶以無規(guī)章的方式切斷淀粉大分子內(nèi)部的α-1，4糖甙鍵而使淀粉生成糊精、低聚糖等，因產(chǎn)物的末端葡萄糖殘基中碳原子為α-構(gòu)形，故稱為α-淀粉酶。大多α-淀粉酶(個別品種除外)不能切斷α-1，6糖甙α-1，4糖甙鍵。目前，α-淀粉酶在我國產(chǎn)量較大，廣泛應(yīng)用于食品、釀造、制藥和紡織等領(lǐng)域。用α-淀粉酶水解淀粉時，要留意水解條件。影響α-pH值、溫度和金屬離子[1]。α-淀粉酶具有反響速度快、效率高、本錢低等優(yōu)勢。對于我國來講，一方面食品與α-滿足市場需求，調(diào)整我國酶制劑工業(yè)的產(chǎn)業(yè)構(gòu)造，節(jié)約外匯支出等都具有格外重要的意義[2]。文獻(xiàn)綜述α-淀粉酶及其性質(zhì)α-淀粉酶α-淀粉酶分布格外廣泛，普及微生物至高等植物，其國際酶學(xué)分類編號是α-1，4糖苷鍵，生成糊精和α-α-淀粉酶泛指α-1，4[1]。α-淀粉酶的性質(zhì)α-pH5.5-8.0時活性較穩(wěn)定，pH4時，酶易失去活性。但pH75515minα-淀粉酶幾乎失活。而用米曲酶生產(chǎn)的α-淀粉酶則相反，在pH為7、溫度為55℃時處理15minpH2.5時，酶的活性完全消逝。α-淀粉酶具有反響速度快、效率高、本錢低等優(yōu)勢。α-淀粉酶是一種金屬酶，Ca2+Ca2+Mg2+α-α-淀粉酶為適應(yīng)生產(chǎn)工α-Ca2+Ca2+等穩(wěn)定劑。α-淀粉酶的應(yīng)用25α-淀粉酶。α-淀粉酶作為保鮮劑應(yīng)用在焙烤工業(yè)中生產(chǎn)各種高品質(zhì)的產(chǎn)品已經(jīng)有幾百年的歷包工業(yè)，使這些產(chǎn)品體積更大，顏色更好，顆粒更松軟。直到今日，焙烤工業(yè)中的α-淀粉酶始終是從大麥麥芽和細(xì)菌、真菌葉提取的。自從19551963年在英國經(jīng)過GRAS級驗證后，真菌淀粉酶始終作為面包的添加劑?，F(xiàn)在，它們應(yīng)用于不同領(lǐng)域?，F(xiàn)α-(改進(jìn)產(chǎn)品的體積和質(zhì)地)，增加生面團中糖的含量，改進(jìn)面包的口感、外皮顏色和焙烤質(zhì)量，還可以延長焙烤食品的保鮮時間。在儲存過程中，面包顆粒變得枯燥，堅硬，表皮不再動聽，導(dǎo)致面包的口感變差。這些變化統(tǒng)稱為變質(zhì)。每年僅僅由于面包變質(zhì)而造成的損失超過一億美元。各種傳統(tǒng)的添加劑被用于防止食品變質(zhì)，改善焙烤食品的質(zhì)地和口味。最近，人們開頭關(guān)注酶作為防腐劑、保鮮劑在生面團改進(jìn)方面的作用，如支鏈淀α-最近的趨勢是使用中溫穩(wěn)定(ITS)α-淀粉酶，它們在淀粉液化后活性很高，但在焙烤過程α-α-淀粉酶僅僅在幾種微生物中被覺察。世界上僅有諾維信、丹尼斯克等少數(shù)幾家大型酶α-α-年來，浙江、江蘇等地的幾家高校相繼開展了真菌α-淀粉酶的爭論工作，但仍處于試驗α-淀粉酶的需求量不斷增加；另一方面，由于我國目前不能自主生產(chǎn)真菌α-淀粉酶，每年都要大量進(jìn)口，且價格昂貴，其市場售價一般在350～400元／Kg〔9000u／g〕。因此盡快實現(xiàn)國產(chǎn)化生產(chǎn)，對于滿足市場需求，調(diào)整我國酶制劑工業(yè)的產(chǎn)業(yè)構(gòu)造，節(jié)約外匯支出等都具有格外重要的意義[1]。pH和培育溫度等方面對產(chǎn)酶條件進(jìn)展優(yōu)化，最終的出最適宜的產(chǎn)酶條件。試驗材料和方法試驗材料土壤：取自蚌埠市李樓面粉廠四周的土壤。所用的藥品氯化銨、硫酸錳、硫酸鎂、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸亞鐵、氯化鈉和氯化鈣等。所用的儀器高壓蒸氣滅菌鍋；pH測定儀；無菌操作臺和JH752紫外可見分光廣度計〔上海箐華科技儀器〔科大創(chuàng)股份電子天平〔上海梅特勒-托利多儀器〕；HH-1數(shù)量恒溫水浴鍋〔江蘇省金榮華培育基的制備牛肉膏蛋白胨培育基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，CaC125g，瓊脂20g，水1000mL，pH7.0～7.2，121℃滅菌20min。淀粉初篩培育基：1.5-2%，PH值為7.0。復(fù)篩液體培育基：淀粉60g，蛋白胨30.0g，Na2HPO40.05g．MgSO4·7H2O0.1g，NaC10.1g，pH7.0，0.1MPa滅菌20min。復(fù)篩平板培育基：淀粉20g，瓊脂15g，pH值為7.0，加熱溶化后倒平板，每皿20mL，厚3mm；小圓濾紙片：直徑5mm。種子培育基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖1g／L，NaH2PO43g/L，pH7.0。產(chǎn)酶培育基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖1g／L，可溶性淀粉5g/L，KI-I2PO42g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，CaC12·2H2O0.2g／L，pH7.0。試劑的制備5mmol／L碘液取碘酸鉀(KIO3)0.3567g，碘化鉀(KI)4.5g，蒸餾水800mL攪拌混勻后，緩緩滴加，邊攪邊參加l2mol／L濃鹽酸0.9mL?；靹蚝蠹诱麴s水至1000mL。此液置琥珀色瓶中。1mol／LNaOH取4g固體NaOH放入100mL蒸餾水，混勻。1mol／L取10mL濃硫酸倒入100mL蒸餾水中，攪拌混勻。試驗方法3.4.1[3]5g，倒入盛有95mL30min制成土l0-110-1的土壤懸液0.5mL，放入4.5mLl0-2l0-3～l0-610-4l0-5、l0-6土壤稀釋液各0.5mL，涂布于淀粉初篩平板培育基外表，每個稀釋度涂布3塊平板，37℃下恒溫培育18h，待長出菌落后，滴加盧戈氏碘液，挑取有明顯淀粉水解圈的單菌落，反復(fù)劃線分別純化，斜面保存，作為初篩菌株編號保藏。3.4.2[4]將初篩菌株接種到復(fù)篩液體培育基中進(jìn)展液態(tài)培育，發(fā)酵48h后，取直徑5mm的3mm厚的復(fù)篩固體培育基上，用毛細(xì)管吸取等量發(fā)酵液，分別滴到小圓濾紙片上，65℃培育2h后，滴加稀碘液，測水解圈直徑。3.4.3[5]菌落培育特征觀看：用接種環(huán)沾取少量菌苔在牛肉膏蛋白胨平板上劃線，37℃培育3-7d，從以下幾個方面觀看單菌落的形態(tài)特征：大小，顏色，形態(tài)，邊緣，高度，透亮度。芽孢有無及其外形、大小和著生位置?！舶牍腆w穿刺法適溫培育2-3d〔穿刺法：是由斜面菌種接種到固〕接種環(huán)挑18-24h的菌苔，涂抹在濾紙上，如呈玫瑰紅色為陽性，在1min以后顯示者仍按陰性處理。②接觸酶試驗：接種試驗菌，適溫培育18-24h，將3%的過氧化氫滴于菌苔上，靜1-3分鐘后，觀看有無氣泡產(chǎn)生，如有則為陽性。③葡萄糖氧化發(fā)酵試驗：將培育18-24h的菌株穿刺接種于葡萄糖氧化發(fā)酵培育基，每株接四支〔培育基在使用前用沸水溶化后快速用冷水冷卻，凝固后馬上使用。其中的兩支用液體石蠟封管，隔絕空氣為閉管，另外兩只不封為開管。同時還要有不接種的開閉管為比照。30℃培育，在第1，2，4，7d個觀看一次。氧化產(chǎn)酸：僅開管產(chǎn)酸變黃，而且培育基上層產(chǎn)酸變色局部不超過1cm。發(fā)酵產(chǎn)酸：開管閉管均產(chǎn)酸，沿穿刺線產(chǎn)酸變色。如產(chǎn)氣，則在瓊脂柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡。④V·PM·R試驗：兩個試驗的培育液一樣，接種培育也一樣，將試驗菌接種2、4、6d140%NaOH0.5ml-萘酚，用力振蕩，15-30minM·R試1-2滴甲基紅試劑，如呈紅色則為陽性，黃色則為陰性。⑤淀粉水解試驗：將試驗菌在平板上點種，適溫培育2-7d，滴加碘液于菌落上，如色則為陽性。204d取出于20℃以下的環(huán)境中觀看菌的生長狀況及液化外形。假設(shè)20℃以下變?yōu)榭闪魈实囊后w，則為明膠液化陽性。2-7d的培育液，沿管壁3-5ml的吲哚試劑，液層界面消滅紅色表示產(chǎn)生吲哚，即為陽性。⑧檸檬酸鹽生長試驗：將試驗菌在平板上點種，適溫培育3-5d，如該菌可在平板上生長并將培育基由原來的淡黃色變?yōu)槊倒寮t色，則為陽性，顏色不變者為陰性。⑨碳源的利用：將菌株在平板上點種，適溫培育3-5d，同時每個試驗菌都做一個未培育基者為陽性，否則為陰性。NaCl2％，5％，7％，3-7d與比照管比較目測其生長狀況，推斷其對不同滲透壓得耐受性。酶活測定以及酶活定義[6]承受Yoo5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.537℃水浴中預(yù)熱10620nm處測光密度。0.5mL水代替0.5mL反響液為空白，以不加酶液(加同體積的緩沖液)的管為比照。酶活力依據(jù)以下公式計算：(R0R)×50×D／R。式中：R0，R分別表示比照和反響液的光密度，D為酶的稀釋倍數(shù)。條件下，5min內(nèi)水解1mg1個活力單位。不同培育條件對產(chǎn)酶的影響PH對產(chǎn)酶的影響9，每個三角瓶接入種子培育基1ml后培育24h。2530354024h定不同溫度對酶活的影響。在250mL三角瓶中裝入50mL1ml后分別培育6h、12h、24h、36h、48h、96h[7]。試驗結(jié)果4.1初篩結(jié)果菌株表4-1菌體〔D,mm〕水解圈直徑比水解圈(d,mm)d/DB12.57.83.12B22.86.92.46B32.07.13.55B42.16.93.29B51.74.52.65利用淀粉固體培育基進(jìn)展初步分別，能夠在其上生長，并且有淀粉水解圈產(chǎn)生的菌以供后期復(fù)篩所用。4.2復(fù)篩結(jié)果菌株表4-2濾紙片〔D,mm〕水解圈測量水解圈(d,mm)d/DB15.016.03.20B35.014.52.90B45.015.33.06王麗麗等在進(jìn)展產(chǎn)酶菌株的篩選時覺察，平板菌落水解圈直徑與其搖瓶酶活不相面保存。鑒定對復(fù)篩出的三個菌株進(jìn)展菌種鑒定，依據(jù)《伯杰式細(xì)菌鑒定手冊》[]《常見細(xì)菌[]比照查找鑒定結(jié)果。性狀G染色芽孢

表4-3細(xì)菌鑒定結(jié)果B B B1 3 4+ + +有 有 有細(xì)胞外形接觸酶氧化酶運動性淀粉水解M.RV.P檸檬酸鹽吲哚明膠液化葡萄糖氧化發(fā)酵產(chǎn)酸

長桿狀-+++++++++

長桿狀 桿狀- ++ -+ ++ ++ ++ -+ +- -+ ++ -1342%++1342%+++5%+++7%+++10%++-鹽濃度 B B B134葡萄糖++134葡萄糖+++乳糖+++蔗糖+++甘露醇+++碳源 B B BB1和B3菌落呈不規(guī)章狀，不透亮，枯燥，色暗，革蘭氏反響為陽性，芽孢橢圓狀，中生，B4菌落邊緣為毛發(fā)狀，不透亮，枯燥，不宜挑起，革蘭氏反響為陽性，桿狀，芽B1和B3為枯草芽孢桿菌，B4疑似為地衣芽孢桿菌。不同條件對產(chǎn)酶的影響本試驗從土壤中篩到兩株產(chǎn)酶力量較強的菌株B1和B3，經(jīng)鑒定初步認(rèn)為是枯草芽37℃，24h，測得兩株枯草芽孢桿菌的酶活如圖4-1所示?！场不蠲?/p>

1716.51615.51514.51413.51312.5

B1 B3菌株圖4-1不同菌株的酶活B1的酶活相對B3略高一些，這與復(fù)篩時，透亮圈的直徑比值相符。本試驗承受B1做發(fā)酵條件對產(chǎn)酶的影響。起始pH由于承受搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵過程中的pH值不好掌握，所以本試驗爭論起始pH對產(chǎn)酶8和9，37℃培育24h。起始pH對產(chǎn)酶的影響如圖4-2。120100〕% 80活60酶對40相2005 6 7 8 9pH值圖4-2起始pH值對酶活的影響由圖4-2可知，該菌株對pH的適應(yīng)性較廣，在5-8的范圍內(nèi)都能很好生長，最適pH為7。pH主要通過影響菌體細(xì)胞膜電荷、膜滲透性及養(yǎng)分物質(zhì)離子化程度，從而影響菌體圍。培育溫度選取25、30、35、40、45℃作為培育溫度，在搖瓶發(fā)酵培育條件下培育24h，分別測定不同溫度對酶活的影響。結(jié)果見圖3-3。120100〕80〔活60酶相對40相20025 30 35溫度〔℃〕

40 45圖4-3溫度對酶活的影響該菌株的溫度適應(yīng)性較強，在上述溫度中都能很好生長，但是最正確生長溫度還是37℃，在30℃-40℃的范圍內(nèi)，產(chǎn)酶力量都比較強。溫度主要通過轉(zhuǎn)變酶反響速率來影響培育時間該菌株在37℃下，培育6h、12h、24h、36h、48h，96h，分別測不同培育時間下的酶活。結(jié)果如圖4-4。120100〕% 活60酶對40相200

6 12 24 36時間〔h〕

48 96圖4-4不同培育時間對產(chǎn)酶的影響由圖可知，該菌株在12-48h產(chǎn)酶力量都比較強，最正確產(chǎn)酶的時間為24h。這是由于，菌體在前12個小時，處于生長延滯期和對數(shù)生長期，此時菌體以生長為主，產(chǎn)酶較少，隨后菌體生特長于穩(wěn)定期，此時產(chǎn)酶力量較強，隨著時間的延長，由于能量的消耗，菌體生特長于衰亡期，產(chǎn)酶的力量也相應(yīng)削減。結(jié)論與展望結(jié)論初篩和復(fù)篩的結(jié)果強的菌株。鑒定結(jié)果通過細(xì)菌的形態(tài)觀看和生理生化試驗，比照《伯杰式細(xì)菌鑒定手冊》[8]，《常見細(xì)不同條件對產(chǎn)酶的影響?pH值是菌種生長的化學(xué)因子,對微生物生長的影響很大。在培育微生物時，pH可以引起細(xì)胞膜電荷變化,以及影響?zhàn)B分物離子化程度，從而影響微生物對養(yǎng)分物的吸取。經(jīng)試驗得知，本試驗菌株產(chǎn)酶的最適PH為7.0左右。?溫度主要通過轉(zhuǎn)變酶反響速率來影響菌體的生長。一般培育溫度上升，酶反響都有一個最適宜某種代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的最適溫度。由試驗可知,枯草桿菌發(fā)酵產(chǎn)α-淀粉酶的最適溫度為37℃。階段的時間性都不一樣。經(jīng)爭論知道該菌株在培育24h左右產(chǎn)酶較高。本試驗只是對枯草桿菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)α-淀粉酶條件的單因素進(jìn)展?fàn)幷?，除上述試驗以的最正確產(chǎn)酶條件。同時可以對枯草桿菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)α-淀粉酶的條件加以爭論。a-淀粉酶的應(yīng)用前景與展望a-1965BF7658生產(chǎn)a-淀粉酶。1964年我國開頭了酶法水解淀粉生產(chǎn)葡萄糖工藝的爭論。l979年9月通過了酶法注射葡萄糖工藝的鑒定，并先后在華北制藥廠、河北東風(fēng)制藥廠、鄭州嵩山制藥廠等單位得到應(yīng)用，取得了良好的經(jīng)濟效益。與傳統(tǒng)的酸法相比呵以提高收率10％，降低本錢15酒精發(fā)酵、黃酒釀造、醬油制造、醋生產(chǎn)等方面也已經(jīng)爭論成功并投入生產(chǎn)。α-淀粉酶的調(diào)控基因，探討了有關(guān)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化和基因克隆等育種技術(shù)。將枯草芽孢桿菌重組體的基因引入生產(chǎn)菌株，使α-淀粉酶產(chǎn)量提高7～10倍，并已應(yīng)用于食品和制酒工業(yè)，給選淀粉酶菌株開創(chuàng)了的途徑。α-淀粉酶已經(jīng)成為工業(yè)應(yīng)用中最為重要的酶之一，并且大量的微生物可以用以高效到。得益于現(xiàn)代生物技術(shù)的進(jìn)展，α-淀粉酶在制藥方面的重要性日益凸顯。固然，食品和淀粉工業(yè)仍舊是主要市場，α-淀粉酶在這些領(lǐng)域的需求仍舊是最大的【11，12】。謝 辭范，樸實無華、平易近人的人格魅力，使我如沐春風(fēng)、倍感溫馨、終生難忘.同時，我順當(dāng)?shù)耐瓿闪水厴I(yè)論文設(shè)計，祝福他們今后工作學(xué)習(xí)順當(dāng)。在此，特向敬重的教師致以最崇高的敬意和誠意的感謝。誠意感謝曹教師和田教師設(shè)計在此向你們表示深深的謝意。參考文獻(xiàn)α-淀粉酶的爭論.四川食品與發(fā)酵.2007,43(140):24-26.態(tài)制劑.2006,11:50-52.料.2006,02:59-61.α-淀粉酶產(chǎn)生菌的平板篩選法的爭論與改進(jìn).河北輕化工學(xué)院學(xué)報.1998,19(2):33-36.李力.現(xiàn)代細(xì)菌培育基和生化試驗手冊.中國生命科學(xué)論壇.2008業(yè)現(xiàn)代化.2008,15(2):15-18.聶光軍，薛正蓮，岳文瑾等.不同濃度的秋水仙堿對枯草桿菌產(chǎn)α-淀粉酶的影響.安徽工程科技學(xué)院學(xué)報.2006,21(3):15-17.Breed1984年.東秀珠，蔡妙英等.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊.科學(xué)出版社.2007年.朱何東，陳遠(yuǎn)釗，常峰等.高溫α-技.2006,05:30-32.2007,12：70-74.孫曉菲，李愛江.α-淀粉酶的應(yīng)用及爭論現(xiàn)狀.河南科技大學(xué)食品與生物工程