微生物實(shí)驗(yàn)報告：普通染色和格蘭染色

實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌的普通染色和革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆占?xì)菌涂片標(biāo)本的制備方法和普通染色的步驟；掌握革蘭氏染色法的步驟和關(guān)鍵點(diǎn)；識別細(xì)菌的革蘭氏染色結(jié)果；學(xué)習(xí)無菌操作技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理一般認(rèn)為革蘭陽性細(xì)菌的肽聚糖層較厚，經(jīng)乙醇處理后使之發(fā)生脫水作用而使孔徑縮小，結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物保留在細(xì)胞內(nèi)而不被脫色；而革蘭陰性細(xì)菌的肽聚糖層很薄，脂肪含量高，經(jīng)乙醇處理后部份細(xì)胞壁可能被溶解并改變其組織狀態(tài)，細(xì)胞壁孔徑大，不能阻止溶劑透入，因而將結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物洗去而被脫色。雖然如此，革蘭染色的差異并不能完全認(rèn)為是化學(xué)的差別，也有物理結(jié)構(gòu)不同的結(jié)果，因?yàn)榻湍妇?xì)胞壁的成份完全和細(xì)菌不同，但具有革蘭染色陽性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)器材載玻片，蓋玻片，接種環(huán)，酒精燈，顯微鏡、擦鏡紙、鏡油、擦鏡液；結(jié)晶紫、革氏碘染液、95%酒精、番紅染液；枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和未知菌的18小時的液體培養(yǎng)液，酵母菌平板，大腸桿菌平板，牙垢。實(shí)驗(yàn)步驟涂片左手持菌液EP管，右手持接種環(huán)，在火上對接種環(huán)滅菌后，從EP管中取一環(huán)培養(yǎng)液，于載玻片中央涂成薄層（事先在背面做好標(biāo)記圓圈），將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌。若是從平板上取材，則事先在載玻片上滴一小滴水，在火焰附近把平板打開一小口，用接種環(huán)調(diào)取菌落邊緣的物質(zhì)涂于水滴上。室溫下自然干燥。固定手持或鑷子夾載玻片一端，標(biāo)本面朝上，在燈的火焰外側(cè)快速來回移動3~4次，共約3~4秒。要求玻片溫度不超過60℃初染滴加1滴草酸銨結(jié)晶紫染液，染色1分鐘，水洗，吸干。媒染用碘液沖去殘留水，再加1滴碘液覆蓋涂片1分鐘，水洗，吸干。脫色用吸水紙吸去玻片上的殘留水，滴加95%的乙醇脫色，輕輕搖動玻片，倒掉脫色液，直至流出的乙醇無紫色時，立即水洗，吸干。脫色時間20~30秒。復(fù)染滴加1滴蕃紅染液復(fù)染1-3分鐘以上，水洗。鏡檢照相吸干載玻片背面及標(biāo)本周圍水漬,滴上半滴水，蓋上蓋玻片,油鏡鏡檢；看到合適的結(jié)果后拿著標(biāo)本到4樓實(shí)驗(yàn)室顯微攝影。實(shí)驗(yàn)結(jié)果6張裝片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，照片見圖1。表1.各菌種的染色結(jié)果及形態(tài)特征菌名形態(tài)特征染色結(jié)果結(jié)論枯草芽孢桿菌個體較大，呈桿狀，多見成對短鏈狀紅色，G－假陰性金黃色葡萄球菌個體小，球狀，成團(tuán)存在紫色，G＋符合理論大腸桿菌個體小，短棒狀，分散存在紅色，G－符合理論未知菌個體小，球狀，分散存在紫色，G＋未知菌為G＋菌酵母個體巨大，卵狀，成團(tuán)存在紫色，G＋符合理論牙垢個體小，球狀，成團(tuán)存在，雜質(zhì)較多紫色，G＋牙垢中基本上為G＋菌（a）枯草芽孢桿菌，10×100倍放大（b）金黃色葡萄球菌，10×100倍放大（c）大腸桿菌，10×100倍放大(d)未知菌，10×100倍放大（e）酵母，10×100倍放大（f）牙垢，10×100倍放大圖1.微生物革蘭氏染色顯微照片討論涂片時的干燥在涂片時，如果是直接調(diào)菌液，則用接種環(huán)一蘸即可，如果是從平板菌落上取樣，事先滴水時千萬不要滴太大的液滴，總之是為了使涂片盡快干燥。如果不慎水加多了，不能用吸水紙吸，因?yàn)榇藭r還沒有固定，會將大部分細(xì)菌吸走?？煽紤]放到酒精燈上方較遠(yuǎn)處，微熱干燥，以手心能感到溫暖為宜。不能太低，會對細(xì)菌造成殺傷。固定本次實(shí)驗(yàn)中較難掌握度的一步。在火焰上方約10cm處來回過3～4次即可。固定不充分的話后續(xù)清洗時會將細(xì)菌洗掉，固定過熱的話又將細(xì)菌燒焦，不能上色。需要注意的是，熱固定會改變細(xì)菌的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和外形，若研究菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)時還是要用化學(xué)固定法。脫色時間最難掌握度的一步！脫色時，最初洗下的酒精都看不出初染的藍(lán)色，也就無法判斷脫色是否充分，所以只能通過多次實(shí)驗(yàn)，建立洗脫時間梯度來逐步摸索。我們的金黃色葡萄球菌做了3次才得到勉強(qiáng)理想的染色結(jié)果。個人覺得用不了書上說的30s，洗2次大約15s就足夠了?；A(chǔ)實(shí)驗(yàn)，我們可以根據(jù)已知的菌種知識來調(diào)節(jié)洗脫時間，比如G＋就洗短點(diǎn)，G－就洗長點(diǎn)，但是對于以后的未知菌種，這樣做是不可以而且不可能的！所以一定要在基礎(chǔ)試驗(yàn)中打下扎實(shí)的革蘭氏染色操作基礎(chǔ)，標(biāo)準(zhǔn)化動作，以后才能對未知菌種做出正確鑒定。大腸桿菌的復(fù)染老師事先提醒過大腸桿菌不好染色，復(fù)染可延長時間。我們復(fù)染5分鐘后鏡檢，發(fā)現(xiàn)染色效果不理想，于是小心地拆下蓋玻片不使鏡油污染樣品，再次滴加蕃紅染色5分鐘，累計10分鐘復(fù)染。第二次鏡檢的結(jié)果就好多了。說明我們的補(bǔ)救方法是可行的。另外，我們對面是幾位重做實(shí)驗(yàn)的同學(xué)，助教為他們準(zhǔn)備了大腸桿菌平板。一開始我們誤將此板當(dāng)作酵母，根本沒考慮二者菌落外形的巨大差異，制片后一致在困惑酵母怎么這么小而且是陰性的（我們居然分不清菌落特征卻還記得分清細(xì)菌個體），重復(fù)制片結(jié)果仍然如此！苦惱中求助助教，才發(fā)現(xiàn)取錯樣品了。拿到酵母平板后，驚嘆于二者菌落外形差異如此巨大我們卻沒有注意到，看來上次課觀察平板寫完報告后就忽略了。這提醒我們即使是基礎(chǔ)教學(xué)試驗(yàn)這種材料很固定的實(shí)驗(yàn)也要小心，自己要有判斷能力，而且千萬不能忘了前面的成果。值得一提的是，我們一共做了3塊大腸桿菌片子（2固1液），染色都很不錯，有的同學(xué)卻染了一下午才得到理想結(jié)果。我們可謂“無心插柳柳成蔭”了。這同時也說明，平板比液體培養(yǎng)基適于做染色實(shí)驗(yàn)。染色結(jié)果這次報告中唯一不理想的染色是枯草芽孢桿菌，是我同組制作的。但是這張片子我當(dāng)時看過，的的確確是紫色！這是我們第一張片子，照相前非常謹(jǐn)慎，請教助教鑒定后才決定拍照的，不知道為什么在數(shù)字?jǐn)z影的成像系統(tǒng)下就失真了。肉眼觀察可是千真萬確的陽性結(jié)果啊……本想像以前處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果一樣PS一下，突然意識到這次是染色實(shí)驗(yàn)，看的就是顏色結(jié)果，PS就毫無意義了。所以只好忍了，暫且算作假陰性吧。這再次說明，攝影技術(shù)發(fā)達(dá)的今天，肉眼仍然是不可替代的。酵母菌能進(jìn)行染色嗎？結(jié)果如何？為什么？能，顯革蘭氏陽性結(jié)果。酵母的細(xì)胞壁不含肽聚糖，主要成分是葡聚糖、甘露聚糖，還有幾丁質(zhì)等，它們都是多糖的復(fù)雜分支聚合物，不溶于乙醇，且酵母細(xì)胞壁脂類較少，因此在媒染后，結(jié)晶紫-碘復(fù)合物不易脫出細(xì)胞壁，故呈現(xiàn)革蘭氏陽性反應(yīng)。思考題牙垢里大概能看到幾類菌，哪幾種較多？我的樣品中幾乎全是革蘭氏陽性球菌。通過網(wǎng)上查資料可知：牙垢是在牙齒表面逐漸沉積的生物薄膜，由食物殘?jiān)⒚撀涞目谇簧掀ぜ?xì)胞、唾液和細(xì)菌構(gòu)成，其中細(xì)菌主要是正常口腔內(nèi)存在的鏈球菌、厭氧菌等。這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，也解釋了為什么有的組的樣品中含有細(xì)胞狀物體和固體顆粒，那是口腔上皮細(xì)胞和食物殘?jiān)?。建議以后做此實(shí)驗(yàn)前刷牙或漱口，減少雜質(zhì)對觀察細(xì)菌的干擾。酵母菌能進(jìn)行染色嗎？結(jié)果如何？為什么？能，顯革蘭氏陽性結(jié)果。酵母的細(xì)胞壁不含肽聚糖，主