柱色譜法分離甲基橙和亞甲基藍(lán)==

柱色譜實(shí)驗(yàn)教學(xué)中甲基橙和亞甲基藍(lán)的分離和測(cè)定方法柱色譜是色譜分析方法中的一種，由于柱色譜能夠較大量地有交攵分離和提純有機(jī)化合物，所以廣泛應(yīng)用在化學(xué)分析，藥物研究，天然物質(zhì)提取，醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。在大學(xué)有機(jī)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，往往都設(shè)有柱色譜實(shí)驗(yàn)課。在實(shí)驗(yàn)教材中，一般采用中性氧化鋁為固定相分離甲基橙和亞甲基藍(lán)的混合物[1-3],但此方法分離的色譜帶有擴(kuò)散現(xiàn)象，影響分離效果；且實(shí)驗(yàn)中只有定性觀察，不進(jìn)行定量操作。在本實(shí)驗(yàn)中，我們改用硅膠為固定相，選用了新的樣品溶劑和洗脫劑，在很大程度上抑制了色帶擴(kuò)散，而且色譜帶分明，大大提高了分離效果。在實(shí)驗(yàn)中還增加了定量測(cè)定的內(nèi)容，通過計(jì)算回收率，可對(duì)同學(xué)們的實(shí)驗(yàn)情況進(jìn)行評(píng)判，使你們能夠認(rèn)真收集分離物質(zhì)，不斷地提出問題，調(diào)動(dòng)了你們做實(shí)驗(yàn)的積極性。1實(shí)驗(yàn)材料和方法1.1材料分光光度計(jì)（島津UV22201），玻璃色譜柱。柱色譜用硅膠（100~140目），甲基橙（指示劑）,亞甲基藍(lán)（指示劑）,H2O：95%乙醇=1:1（A液）,0.2molL-1HC1:95%乙醇=1:1（B液）。1.2甲基橙標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制用A液做溶劑，配制甲基橙系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在入max=450nm處測(cè)得甲基橙吸光度（表1）。1.3亞甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制用B液做溶劑，配制亞甲基藍(lán)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在入max=661nm處測(cè)得亞甲基藍(lán)吸光度（表1）。

1.4甲基橙和亞甲基藍(lán)的分離在玻璃色譜柱(d=1cm,l=10cm)底部用脫脂棉輕輕塞緊，稱取4g硅膠于小燒杯中，加入15mL蒸餾水用玻璃棒調(diào)好。在柱中先加入1/2柱高的蒸餾水，打開活塞，在攪動(dòng)下把糊狀硅膠加入柱中同時(shí)調(diào)整活塞使流速為1滴/s。當(dāng)柱中液面將要露出硅膠面時(shí)，加入5mL左右的A液，當(dāng)硅膠面又將要露出時(shí)，關(guān)緊活塞用移液管準(zhǔn)確加入0.50mL以A液做溶劑的混合液(含甲基橙和亞甲基藍(lán)各為0.400g?L-1)。待此混合液將要滲入柱內(nèi)時(shí)，立即用A液洗脫，此時(shí)可以觀察到有鮮明的黃、藍(lán)兩條色帶形成。黃色的甲基橙色帶隨洗脫劑的加入不斷下移，而其頂部藍(lán)色帶不移動(dòng)，當(dāng)黃色帶到達(dá)柱底部時(shí)，更換接受器，全部收集此黃色帶，洗脫時(shí)間約10min。此后改用B液做洗脫劑，這時(shí)可看到藍(lán)色帶開始下移，當(dāng)亞甲基藍(lán)色帶到達(dá)底部時(shí)，更換接受器，全部收集此藍(lán)色帶，洗脫時(shí)間約30min。表1 甲基橙標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)和亞甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)甲基橙亞甲基藍(lán)p/mg-L-1A P/mg-L-1A0.000 0.000 0.000 0.0001.9700.1651.1.9700.1651.TOC\o"1-5"\h\z110 0. 2923.939 0. 326 1.666 0. 4205.909 0. 477 2.221 0. 5477.878 0. 635 2.776 0.6789.848 0. 784 3.331 0.799甲基橙的吸光度&濃度方程為A=kp。其中k=0.0804mg-1L。亞甲基藍(lán)的吸光度&濃度方程為A=kp其中k=0.2445mg-1L。2數(shù)據(jù)處理把收集到的甲基橙溶液用A液定容到25mL的容量瓶中，并在450nm處測(cè)定吸光度A值,甲基橙的回收率可從下公式計(jì)算得到:回收率％=(Ax25x10-3)/(km)。其中k=0.0804mg-1L,m為甲基橙在混合物上樣中的實(shí)際量(mg)。把收集到的亞甲基藍(lán)溶液用B液定容到100mL的容量瓶中，并在661nm處測(cè)定吸光度A值,亞甲基藍(lán)的回收率可從下公式計(jì)算得到:回收率％=(Ax100x10一3)/(km)。其中k=0.2445mg-1L,m為亞甲基藍(lán)在混合物上樣中的實(shí)際量(mg)。表2 甲基橙和亞甲基藍(lán)回收率實(shí)驗(yàn)號(hào)甲基橙A回收率 亞甲基藍(lán)A回收率10.62997.8%0.47697.3%20.62897.6%0.47496.9%30.63097.9%0.47897.8%40.63398.4%0.47697.3%50.62997.8%0.47998.0%平均值97.9%97.5%3討論柱色譜在分離樣品時(shí)，一般要求柱高和直徑之比是8:1。分離同樣量的甲基橙和亞甲基藍(lán)混合物需中性氧化鋁6g［i］采用本實(shí)驗(yàn)方法需硅膠4g就能達(dá)到同樣的分離效果。在進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)前，需把待分離的混合物甲基橙和亞甲基藍(lán)溶于溶劑中，下面是它們的結(jié)構(gòu)式：可以看到，它們結(jié)構(gòu)中既有極性部分，又有非極性部分，通常實(shí)驗(yàn)教材提供的方法是用乙醇做溶劑，在實(shí)際實(shí)驗(yàn)時(shí)，導(dǎo)致甲基橙色帶分散。原因之一是，雖亞甲基藍(lán)溶于乙醇，而甲基橙不溶于乙醇等有機(jī)溶劑，但它們都可溶于水［4］。本實(shí)驗(yàn)改用A液溶解樣品的好處是:一方面能使混合物樣品充分有效地溶解;另一方面，柱色譜實(shí)驗(yàn)時(shí)要求溶解樣品的溶劑極性和溶解度不能太大，也不能太小，前者影響樣品與吸附劑的吸附，后者使柱中樣品色帶分散。實(shí)驗(yàn)證明:用A液為溶劑，既增加了溶解度，又調(diào)整了極性，使甲基橙和亞甲基藍(lán)能集中洗脫下來。⑶實(shí)驗(yàn)教材中以中性氧化鋁做固定相，首先用95%乙醇做洗脫劑洗脫出亞甲基藍(lán)，然后換用0.1molL-1HC1把甲基橙洗脫下來［i］,或者換用水洗脫［2,3］。結(jié)果它們的色帶分散，不清晰，洗脫體積大。原因是甲基橙(pka=3.4)和亞甲基藍(lán)(pka1=4.52,pka2=5.85加］都屬于偏酸性物質(zhì)，氧化鋁對(duì)它們的吸附性大，需較長(zhǎng)時(shí)間才能洗脫下來，因而產(chǎn)生擴(kuò)散現(xiàn)象，使色帶難于觀察，也影響了分離后的處理工作。本實(shí)驗(yàn)換用適用于分離酸性物質(zhì)的硅膠做固定相，用A液做洗脫劑，洗脫次序被重新調(diào)整，首先集中洗脫出甲基橙，之后改用B液做洗脫劑，集中洗脫亞甲基藍(lán)，從而保證這兩種物質(zhì)充分有交攵地分離。亞甲基藍(lán)被硅膠吸附后，只能用乙醇-水的電解質(zhì)溶液方可使亞甲基藍(lán)從硅膠柱上洗脫。這一現(xiàn)象的解釋為:亞甲基藍(lán)分子中有一部分結(jié)構(gòu)相當(dāng)于季銨鹽，以離子態(tài)存在，僅用水或極性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑洗脫不能使它從偏酸性硅膠上解吸，而單獨(dú)用電解質(zhì)水溶液雖然增強(qiáng)了電解質(zhì)的離子與亞甲基藍(lán)分子中的季銨離子部分的作用力，但與亞甲基藍(lán)結(jié)構(gòu)中的非極性部分作用力弱，故洗脫能力弱，這樣單獨(dú)用電解質(zhì)水溶液也達(dá)不到有交攵洗脫的目的，所以只有在有機(jī)溶劑中加些電解質(zhì)水溶液，才能同時(shí)滿足上述要求。電解質(zhì)可以選用HCl、NHCl、NHNO、(NH4)SO、NaCl、NaSO、ZnSO、4、43、 24、 、 24、 4、Na2CO3等物質(zhì),因?yàn)閬喖谆{(lán)結(jié)構(gòu)中有Cl-,考慮到不帶入雜質(zhì)離子，所以選用B液做亞甲基藍(lán)的洗脫劑。在柱色譜實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，由于缺少對(duì)學(xué)生實(shí)驗(yàn)情況的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，學(xué)生實(shí)驗(yàn)開始時(shí)較認(rèn)真，當(dāng)混合物在柱中被分離開，認(rèn)為達(dá)到了實(shí)驗(yàn)要求，往往就不仔細(xì)收集柱中分離出的物質(zhì)。我們針對(duì)這一方面的