臨床研究用人間充質(zhì)干細(xì)胞質(zhì)量檢驗(yàn)規(guī)范-討論版

21/21臨床研究用人間充質(zhì)干細(xì)胞質(zhì)量評價規(guī)范（討論稿）前言人間充質(zhì)干細(xì)胞(humanMSCs,hMSCs)是一類具有一定的自我復(fù)制更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，廣泛存在于胎兒和成人各組織中，如骨髓、脂肪、皮膚、牙髓、肌腱，以及新生兒附屬組織，如臍帶、胎盤、羊膜等等組織。除一定程度的分化潛能外，hMSCs還具有獨(dú)特的免疫調(diào)控和組織再生功能，參與調(diào)控異常免疫反應(yīng)、維護(hù)免疫平衡，幫助機(jī)體形成有利于病損組織細(xì)胞修復(fù)或再生的微環(huán)境，以促進(jìn)損傷組織細(xì)胞的修復(fù)或再生。hMSCs獨(dú)特的生物學(xué)功能決定了其應(yīng)具有廣泛的臨床適應(yīng)癥，并使其成為近十年來細(xì)胞治療領(lǐng)域中發(fā)展最為廣泛、最為迅速的干細(xì)胞類型。過去10年來所積累的大量臨床前及臨床研究數(shù)據(jù)顯示，不同組織來源的hMSCs均具有不同程度，針對不同臨床適應(yīng)癥的治療效果。目前在登記的各種自體或異體組織來源的hMSCs臨床適應(yīng)癥類型或疾病亞型已有上百種，其中常見的臨床適應(yīng)癥類型包括骨關(guān)節(jié)疾病、心血管疾病、器官功能衰竭、神經(jīng)退行性疾病、移植物抗宿主病、多發(fā)性硬化、脊髓損傷、炎性結(jié)腸炎、脊髓側(cè)索硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡，等等。然而，無論是臨床前或臨床研究階段，現(xiàn)有的研究結(jié)果仍都存在不同程度的問題，而所有問題又都不同程度地匯聚到hMSCs的質(zhì)量問題上。其中臨床前研究所表現(xiàn)的問題是，不同研發(fā)者所使用的hMSCs來源、培養(yǎng)體系、制備工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、評價技術(shù)等存在很大差異，也存在質(zhì)量評價內(nèi)容和技術(shù)的合理性等問題，因此導(dǎo)致不同研究者間的研究結(jié)果很難具有可比性，或結(jié)果難以重復(fù)，因此也很難形成相對統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。而臨床研究中所存在的問題是，絕大多數(shù)臨床研究還處在早期階段，所觀察的病例數(shù)還很有限，臨床研究中細(xì)胞質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)化和細(xì)胞使用的規(guī)范性仍存在巨大差異，所有這些尚不足以完全支持hMSCs的安全性和/或療效。除此以外，因hMSCs臨床前研究還遠(yuǎn)不夠完善，對其臨床研究的指導(dǎo)作用還不強(qiáng)，或者臨床前研究與臨床研究存在嚴(yán)重脫節(jié)現(xiàn)象，臨床研究階段細(xì)胞質(zhì)量的穩(wěn)定性研究欠缺，細(xì)胞質(zhì)量評價和受試者評估體系尚未建立，等等。所有這些問題均不同程度地反映出研發(fā)者或從業(yè)者對臨床研究用hMSCs質(zhì)量屬性的認(rèn)識深度和廣度，以及對相關(guān)質(zhì)量的控制能力仍存在很大差異。類似于所有治療性細(xì)胞產(chǎn)品，hMSCs代表著人類醫(yī)藥發(fā)展史上最為復(fù)雜的醫(yī)藥產(chǎn)品，具有傳統(tǒng)醫(yī)藥產(chǎn)品難以比擬的多樣性、變異性、復(fù)雜性和不穩(wěn)定性等質(zhì)量特性。為有效保障包括hMSCs在內(nèi)的所有治療性細(xì)胞的質(zhì)量，為其標(biāo)準(zhǔn)化使用和規(guī)范化管理，就需在相應(yīng)監(jiān)管屬性的規(guī)定下，結(jié)合hMSCs的科學(xué)性和制備工藝相關(guān)風(fēng)險因素等考慮，綜合全面地把握相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)品的質(zhì)量屬性?；谶@一思想，hMSCs應(yīng)具備基本細(xì)胞生物學(xué)屬性、微生物學(xué)安全性、生物學(xué)安全性及生物學(xué)有效性“四大類”質(zhì)量屬性。這“四大類”質(zhì)量屬性，應(yīng)屬于“狹義”質(zhì)量要素，是質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)量體系建立的對象，是臨床前研發(fā)階段首要解決的關(guān)鍵問題，也是整個細(xì)胞產(chǎn)品研發(fā)周期全質(zhì)量要素的基礎(chǔ)。以往我國由于忽視了對這一內(nèi)容的完整性研究和相應(yīng)綜合質(zhì)量體系的建立，因此在一定程度上影響了我國hMSCs臨床研究的高質(zhì)量發(fā)展。為使hMSCs能夠持續(xù)穩(wěn)定地滿足臨床研究的質(zhì)量要求，首先需建立與其“四大類”質(zhì)量屬性相適應(yīng)的質(zhì)量體系。相關(guān)質(zhì)量體系應(yīng)包括以GMP原則為基礎(chǔ)的質(zhì)量保障體系，和由綜合性質(zhì)量評價技術(shù)和評價規(guī)范所構(gòu)成的質(zhì)量評價體系。其中，質(zhì)量評價技術(shù)是指針對hMSCs各質(zhì)量屬性所建立起的、具有共識性的各類物理、化學(xué)及生物學(xué)評價技術(shù)。質(zhì)量評價規(guī)范是規(guī)范在產(chǎn)品研發(fā)或生產(chǎn)制備的不同階段，依據(jù)不同的質(zhì)量控制目標(biāo)，選擇合理的評價技術(shù)或技術(shù)組合，以及合理的評價策略，對相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行有效的質(zhì)量評價，其根本目標(biāo)應(yīng)是提高產(chǎn)品研發(fā)效率和提升產(chǎn)品研發(fā)的管理/監(jiān)管水平。就質(zhì)量體系而言，首先需要建立和完善的，是保障不同組織來源hMSCs共性質(zhì)量屬性/質(zhì)量要求的質(zhì)量體系，包括與之相關(guān)的質(zhì)量評價體系、評價規(guī)范。hMSCs質(zhì)量評價規(guī)范的設(shè)計應(yīng)是依據(jù)相關(guān)領(lǐng)域目前在hMSCs科學(xué)性方面的共識、不同組織來源hMSCs質(zhì)量研究成果及質(zhì)量控制經(jīng)驗(yàn)，以及現(xiàn)階段的管理/監(jiān)管能力和需要，特別是現(xiàn)階段以《干細(xì)胞臨床研究管理辦法（試行）》（2015）和《細(xì)胞制品研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》（2017）為代表的“類雙軌制”管理模式的需要。本文在對有關(guān)hMSCs質(zhì)量研究成果、質(zhì)量評價的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，和在質(zhì)量評價規(guī)范相關(guān)理論探索的基礎(chǔ)上，綜合上述各方面的考慮，提出了《臨床研究用人間充質(zhì)干細(xì)胞質(zhì)量評價規(guī)范（討論稿）》。本文內(nèi)容涵蓋了對hMSCs“四大類”質(zhì)量屬性/質(zhì)量要求的介紹、針對“四大類”質(zhì)量屬性的評價內(nèi)容、不同類型的質(zhì)量評價規(guī)范，和質(zhì)量評價規(guī)范與現(xiàn)行“類雙軌制”管理模式的關(guān)聯(lián)性。希望與hMSCs治療研究各有關(guān)方就本文內(nèi)容進(jìn)行深入討論，使其最終成為服務(wù)于我國hMSCs制劑/制品研發(fā)在質(zhì)量評價規(guī)范上的共識，以便更好地指導(dǎo)和支撐我國hMSCs“臨床研究”備案申報和/或“臨床試驗(yàn)”注冊審評工作。一、hMSCs的質(zhì)量屬性和質(zhì)量要求不同組織來源、符合臨床研究基本監(jiān)管屬性的hMSCs，應(yīng)具備“四大類”質(zhì)量屬性，即基本細(xì)胞生物學(xué)屬性、微生物學(xué)安全性、生物學(xué)安全性和生物學(xué)有效性。這“四大類”質(zhì)量屬性也是臨床研究用hMSCs的‘四大類’質(zhì)量要求。hMSCs的基本細(xì)胞生物學(xué)屬性不同組織來源的hMSCs基本細(xì)胞生物學(xué)屬性應(yīng)包括細(xì)胞鑒別、活性、純度和均一性等。細(xì)胞鑒別的質(zhì)量屬性是由相關(guān)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)、代謝譜學(xué)、分子標(biāo)志物（或標(biāo)志物群）表達(dá)特征，以及獨(dú)特的生物學(xué)功能等屬性構(gòu)成。細(xì)胞活性是由細(xì)胞活率、增殖周期、倍增時間、克隆形成率、端粒酶活性（和/或端粒長度）等生物學(xué)特征綜合體現(xiàn)；細(xì)胞純度和均一性是指在細(xì)胞制備過程中所引入的非相關(guān)細(xì)胞，以及相同來源、相同細(xì)胞類型和相同代次或相同級別的細(xì)胞（如同一級細(xì)胞庫的細(xì)胞）在生物學(xué)特性方面的純度和均一性。hMSCs的微生物學(xué)安全性hMSCs的微生物學(xué)安全性，是指相關(guān)細(xì)胞需滿足無細(xì)菌、真菌、支原體、病毒污染，以及無微生物代謝產(chǎn)物污染的質(zhì)量要求。其中，病毒污染是指來源于供者或是制備工藝所引入的種屬特異病毒（如人源病毒和動物源性病毒）、內(nèi)外源性逆轉(zhuǎn)錄病毒，以及所有非特定病毒因子。微生物代謝產(chǎn)物是以革蘭氏陰性菌所產(chǎn)生的內(nèi)毒素為代表。為確保hMSCs微生物學(xué)安全性，除需建立細(xì)胞供者篩選標(biāo)準(zhǔn)、建立基于cGMP原則的質(zhì)量保障體系外，還需設(shè)立基于各種評價規(guī)范的過程控制及終產(chǎn)品質(zhì)量控制，并通過體外細(xì)胞模型、敏感動物接種及雞胚接種等方法，對潛在污染的微生物及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行有效評價。hMSCs的生物學(xué)安全性hMSCs的生物學(xué)安全性質(zhì)量屬性是指其細(xì)胞內(nèi)在的、由其生物學(xué)特性所決定的，和外在的、誘發(fā)其生物學(xué)特性發(fā)生改變相關(guān)的安全性問題。通過對hMSCs生物學(xué)安全性評價，希望能預(yù)測或排除hMSCs進(jìn)入體后所產(chǎn)生的成瘤性和/或促瘤性、異常免疫反應(yīng)、異常分化、異位遷移或異位停留等生物學(xué)安全性問題。在對hMSCs生物學(xué)安全性進(jìn)行評價時，應(yīng)盡可能考慮相關(guān)細(xì)胞的臨床適應(yīng)癥、給藥途徑、劑量等與臨床治療直接相關(guān)的因素，并利用合適的體內(nèi)、體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯ο嚓P(guān)的生物學(xué)安全性進(jìn)行有效評估。hMSCs生物學(xué)有效性hMSCs生物學(xué)有效性質(zhì)量屬性，是指與其臨床治療效應(yīng)密切相關(guān)的各種生物學(xué)特性或機(jī)制的總和，是臨床前研究階段用于預(yù)測hMSCs臨床治療效應(yīng)的重要質(zhì)量要求。不同組織來源的hMSCs生物學(xué)有效性質(zhì)量屬性，可歸類為誘導(dǎo)分化功能、免疫調(diào)控能力及組織再生功能。其中，誘導(dǎo)分化功能主要是指在體外特定誘導(dǎo)分化條件下，相關(guān)細(xì)胞向目的細(xì)胞分化的能力。目前用于評價hMSCs誘導(dǎo)分化功能的目的細(xì)胞分化，包括成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞分化。免疫調(diào)控功能是指hMSCs釋放免疫調(diào)控分子、抑制促炎性免疫細(xì)胞增殖或活性、促進(jìn)調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞增殖或極化的功能。組織再生功能是指不同組織來源的hMSCs所具有的保護(hù)組織細(xì)胞抗凋亡損傷、促進(jìn)病損組織血管再生、刺激病損組織內(nèi)源性干細(xì)胞增殖和分化等功能。對hMSCs生物學(xué)有效性進(jìn)行評價，需結(jié)合體外細(xì)胞模型和體內(nèi)動物模型進(jìn)行綜合評價。在使用動物模型時，應(yīng)盡可能地在臨床適應(yīng)癥、給藥途徑、劑量等與臨床治療直接相關(guān)因素充分考慮的基礎(chǔ)上，對相關(guān)細(xì)胞生物學(xué)有效性進(jìn)行評價。二、hMSCs的質(zhì)量評價內(nèi)容 在對具體hMSCs制劑/制品進(jìn)行質(zhì)量評價時，可根據(jù)其生物學(xué)特性、制備工藝、風(fēng)險因素、管理目標(biāo)和管理模式的要求，選擇合理的評價內(nèi)容和評價技術(shù)，以特定的質(zhì)量價規(guī)范（見后述）對其進(jìn)行質(zhì)量評價。2.1.hMSCs基本細(xì)胞生物學(xué)屬性的評價內(nèi)容2.1.1.細(xì)胞形態(tài)光學(xué)顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)2.1.2.個體遺傳多態(tài)性或遺傳指紋圖譜-STR（短串聯(lián)重復(fù)序列，shorttandemrepeats）圖譜。用于評價相關(guān)細(xì)胞的獨(dú)立個體來源、純度和可能與其它人源細(xì)胞間的交叉污染。2.1.3.細(xì)胞表面標(biāo)志物的檢測包括對hMSCs陽性表面標(biāo)志物群（如CD73,CD90,CD105,CD44,CD166，其陽性率應(yīng)不低于95%），和陰性表面標(biāo)志物群（如CD11b或CD14、CD19或CD79a、CD34、CD45和HLA-DR，其陽性率應(yīng)不高于2%）進(jìn)行檢測。2.1.4.種屬間細(xì)胞污染的檢測可利用同工酶譜分析或種屬遺傳多態(tài)性基因分析-基于細(xì)胞色素b基因多態(tài)性的核酸擴(kuò)增分析，對相關(guān)細(xì)胞的種屬特征和種屬間不同細(xì)胞交叉污染進(jìn)行評價。2.1.5.細(xì)胞活性通過對細(xì)胞活率、群體倍增時間、克隆形成率、細(xì)胞周期等對細(xì)胞活性進(jìn)行綜合評價。2.1.6.中期染色體核型分析正常染色體核型應(yīng)為46XX或者46XY，無缺失、重復(fù)、倒位、易位等結(jié)構(gòu)異常。2.2.hMSCs微生物學(xué)安全性評價內(nèi)容hMSCs微生物學(xué)安全性檢測應(yīng)包括對細(xì)菌、真菌、支原體、各類病毒等進(jìn)行相關(guān)病原物（如核酸、蛋白、多糖）或微生物代謝物的可直接檢測，也可利用細(xì)胞模型或動物模型，對相關(guān)微生物的存在和效應(yīng)進(jìn)行間接分析。2.2.1.無菌檢測-細(xì)菌、真菌檢測確證性無菌檢測應(yīng)按照現(xiàn)行版藥典所要求的培養(yǎng)法進(jìn)行檢測，還可采用全自動細(xì)菌/分枝桿菌檢測系統(tǒng)進(jìn)行無菌檢測。另外，還可進(jìn)行革蘭氏染色法鏡檢，或針對病原物的核酸或特定代謝物進(jìn)行快速放行檢驗(yàn)?？梢罁?jù)工藝階段、管理需要、臨床應(yīng)用需要等，采用不同時間針對不同工藝階段的細(xì)胞，選擇不同檢測方法。2.2.2.支原體檢測需依據(jù)藥典中規(guī)定的培養(yǎng)法和指示細(xì)胞感染法（或稱DNA染色法）相結(jié)合進(jìn)行確證性支原體檢測。也可應(yīng)用支原體核酸擴(kuò)增方法作為快速放行方法。需根據(jù)不同的評價規(guī)范，針對不同工藝階段的細(xì)胞采取確證方法和放行方法相結(jié)合的支原體檢測。2.2.3.特定病毒和非特定病毒檢測人源特定病毒包括HIV-1/2、HTLV、HBV、HCV、CMV、EBV、人細(xì)小病毒B19、多種亞型的人乳頭瘤病毒（HPV）、人皰疹病毒（HHV）等。相關(guān)檢測以病原體核酸檢測為主，使用國家批準(zhǔn)的體外診斷試劑盒進(jìn)行檢測。牛源病毒的檢測，包括牛副流感病毒、牛腺病毒、牛細(xì)小病毒、牛腹瀉病毒和弧腸孤病毒等。豬源病毒的檢測，包括豬細(xì)小病毒、豬細(xì)環(huán)病毒以及豬圓環(huán)病毒等。逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測，可依次包括逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢測（PERT或PBRT法）、透射電鏡觀察可能存在的病毒顆粒，以及利用特定敏感細(xì)胞對病毒感染力進(jìn)行檢測。非特定病毒（或非特定致病因子）檢測，包括直接細(xì)胞培養(yǎng)法觀察其對異體動物的血吸附性和血凝集效應(yīng)，通過易感細(xì)胞體外接種方法（如三種細(xì)胞傳達(dá)接種法）對可能的細(xì)胞病變效應(yīng)、血吸附和凝集效應(yīng)進(jìn)行評價，和選擇易感動物接種對可能的組織病變效應(yīng)進(jìn)行廣譜性篩查。2.2.4.細(xì)菌內(nèi)毒素檢測應(yīng)使用現(xiàn)行版藥典所建議的凝膠法和光度測定法，以及改良的凝膠法，也稱重組C因子法，用重組C因子代替?zhèn)鹘y(tǒng)凝膠法中所使用的鱟試劑以減少假陽性。2.3.生物學(xué)安全性評價內(nèi)容hMSCs生物學(xué)安全性包括成瘤性和促瘤性、異常免疫反應(yīng)、異常分化等。在生物學(xué)安全性評價中還應(yīng)包含對制備工藝中使用的部分添加物、動物源性血清、輔料等殘留物進(jìn)行檢測。2.3.1成瘤性和促瘤性檢測成瘤性檢測是評價所檢測細(xì)胞在免疫缺陷動物體內(nèi)形成腫瘤的能力。除動物試驗(yàn)外，也可通過體外軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)、端粒酶活性檢測，對受檢細(xì)胞的成瘤性風(fēng)險進(jìn)行間接評估。促瘤性檢測是基于hMSCs的免疫抑制功能，可能形成有利于體內(nèi)已存在的腫瘤細(xì)胞生長或進(jìn)一步惡化的微環(huán)境而設(shè)計的檢測內(nèi)容。促瘤性的檢測可通過hMSCs與具有成瘤性的、不同性質(zhì)的（如實(shí)體瘤和血液腫瘤）的人源腫瘤細(xì)胞，同時或先后接種在同一免疫缺陷動物的不同部位，以觀察hMSCs對具有成瘤性的腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用。2.3.2異常免疫反應(yīng)異常免疫反應(yīng)的檢測包括對hMSCs細(xì)胞自身免疫相容抗原HLAs分子、免疫共刺激分子、促炎因子等的表達(dá)進(jìn)行檢測，和hMSCs對異體免疫細(xì)胞的增殖/活化（如總淋巴細(xì)胞增殖）的檢測，以及對活化的免疫細(xì)胞相關(guān)促炎因子（如IFN,TNF）釋放效應(yīng)的檢測。2.3.4殘留物的檢測hMSCs制備過程中特殊的培養(yǎng)基成分、添加成分或制備工藝中殘存的雜質(zhì)，如牛血清蛋白、胰酶、抗生素、DMSO、特定細(xì)胞因子等，應(yīng)在制劑/制品中予以清除，并在質(zhì)量評價中對相關(guān)殘留進(jìn)行檢測。2.4.生物學(xué)有效性的評價內(nèi)容2.4.1多向分化功能的評價內(nèi)容對不同組織來源的hMSCs多向分化功能評價，應(yīng)包括成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞分化功能的評價，其中可以成骨細(xì)胞分化作為代表性評價內(nèi)容。此外，可根據(jù)臨床適應(yīng)癥的不同，選擇適應(yīng)癥相關(guān)的目標(biāo)分化細(xì)胞（如肝上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、胰島細(xì)胞等）的分化功能進(jìn)行評價。2.4.2.免疫調(diào)控功能的評價內(nèi)容hMSCs的免疫調(diào)控功能表現(xiàn)為抑制促炎性免疫細(xì)胞增殖活化、抑制免疫細(xì)胞釋放炎癥因子，和促進(jìn)調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞增殖或極化，以及hMSCs細(xì)胞自身分泌不同類型免疫調(diào)控因子的能力。具體評價內(nèi)容可包括hMSCs抑制活化后的（異體）淋巴細(xì)胞增殖、抑制促炎的Th1/Th17淋巴細(xì)胞增殖，和促進(jìn)調(diào)節(jié)性Treg淋巴細(xì)胞增殖或極化；hMSCs抑制活化的免疫細(xì)胞釋放炎癥因子（如對TNF-α、IFN-γ、IL-17A等促炎因子釋放的抑制）；hMSCs在靜息狀態(tài)下分泌PGE2等調(diào)控因子，和在炎性因子（如IFN）激活的情況下分泌IDO1等因子進(jìn)行評價。2.4.3.hMSCs組織再生功能的評價內(nèi)容對hMSCs促進(jìn)病損組織細(xì)胞再生功能的評價包括其保護(hù)組織細(xì)胞抗凋亡損傷、促進(jìn)新生血管形成、促進(jìn)巨噬細(xì)胞從M0/M1型向M2型極化，促進(jìn)病損組織內(nèi)源性干細(xì)胞或前體細(xì)胞增殖和分化，或促進(jìn)已分化的組織細(xì)胞發(fā)生跨系分化(trans-differentiation)，以及hMSCs細(xì)胞自身可分泌不同類型的生長因子促進(jìn)組織損傷修復(fù)或再生。具有促進(jìn)組織再生功能的生長因子包括肝細(xì)胞生長因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)、血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、胰島素樣生長因子-1(insulinlikegrowthfactor,IGF-1)、神經(jīng)營養(yǎng)因子(glialcelll-derivedneurotrophicfactor,GDNF，和brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblastgrowthfactor,FGF)等。三、hMSCs的質(zhì)量評價規(guī)范 hMSCs質(zhì)量評價規(guī)范是其質(zhì)量評價體系的重要組成部分，是在hMSCs產(chǎn)品研發(fā)的不同階段，針對不同階段的細(xì)胞，選擇不同的質(zhì)量評價內(nèi)容和相應(yīng)評價技術(shù)，以滿足不同質(zhì)量控制目標(biāo)和管理目標(biāo)所構(gòu)成的各類質(zhì)量評價方式。3.1hMSCs質(zhì)量評價規(guī)范制定的依據(jù)hMSCs質(zhì)量評價規(guī)范的總體依據(jù)是其科學(xué)性、制備工藝、風(fēng)險因素分析、質(zhì)量控制目標(biāo)和與之相對應(yīng)的管理或監(jiān)管目標(biāo)，以及評價策略。hMSCs的基本制備工藝包括，組織獲取-獲得細(xì)胞（經(jīng)酶消化和/或機(jī)械處理）-培養(yǎng)擴(kuò)增-消化傳代-建立細(xì)胞庫（包括主細(xì)胞庫、工作細(xì)胞庫）-復(fù)蘇擴(kuò)增-制劑制備。這一過程整體上只包括組織細(xì)胞獲取、培養(yǎng)擴(kuò)增、凍存復(fù)蘇等基礎(chǔ)性細(xì)胞操作技術(shù)，其中的每一階段都可能引入不同類型微生物安全性風(fēng)險。其中，源自供者的微生物是第一重要微生物污染源。在基礎(chǔ)制備工藝的不同階段，可對相應(yīng)的細(xì)胞進(jìn)行特殊的物理、化學(xué)或生物學(xué)處理以提高細(xì)胞治療效應(yīng)。生物學(xué)處理主要包括對hMSCs的基因修飾。然而，不同類型、不同程度的特殊處理，可能對細(xì)胞其他質(zhì)量屬性，特別是對其生物學(xué)安全性產(chǎn)生嚴(yán)重影響。因此，需通過對特殊處理相關(guān)的制備工藝和相關(guān)風(fēng)險進(jìn)行分析，確定特殊處理相關(guān)聯(lián)的質(zhì)量屬性，并設(shè)計合理的質(zhì)量評價規(guī)范對特殊處理細(xì)胞進(jìn)行綜合有效的質(zhì)量評價。質(zhì)量評價規(guī)范涉及細(xì)胞的批次、代次、階段形態(tài)等關(guān)鍵因素。細(xì)胞批次包括來源批次和生產(chǎn)制備批次。其中，同一來源批次是指由同一供體、同一組織、同一時間、使用同一工藝采集、分離并最終獲得的hMSCs。而生產(chǎn)制備批次是指基于同一組織來源批次，經(jīng)后續(xù)的工藝過程所制備的細(xì)胞制劑。如在不同時間由相同級別細(xì)胞庫所制備的hMSCs制劑為不同制備批次的細(xì)胞。細(xì)胞代次包括使用代次和擴(kuò)展代次，使用代次是指臨床治療用的細(xì)胞代次，擴(kuò)展代次是指在使用代次基礎(chǔ)上不同程度的擴(kuò)增代次。對數(shù)量多和/或擴(kuò)增能力強(qiáng)的細(xì)胞，應(yīng)鼓勵建立多級細(xì)胞庫，以保障在相同工藝階段的不同細(xì)胞具備質(zhì)量的均一性，和保障臨床應(yīng)用過程中相同質(zhì)量細(xì)胞數(shù)量的充足性。各級細(xì)胞庫的細(xì)胞應(yīng)是作為中間細(xì)胞形態(tài)質(zhì)量評價的重要內(nèi)容。終末細(xì)胞制劑是指最終工藝階段所制備的細(xì)胞，特別是來自于工作庫的細(xì)胞，經(jīng)與輔料混合所形成的可直接應(yīng)用于受試者的細(xì)胞形態(tài)，或經(jīng)與輔料混合再凍存后，并可隨時復(fù)蘇直接使用的細(xì)胞形態(tài)。評價策略的目的是保障合理質(zhì)量屬性的覆蓋率，同時，提高評價效率、降低評價成本。如質(zhì)量評價中涉及同一組織來源批次的不同代次或不同階段的細(xì)胞，需盡量減少細(xì)胞的使用量和減少相同評價項(xiàng)目在不同評價對象中的重復(fù)性。對建立不同類型hMSCs質(zhì)量評價規(guī)范的考慮在建立hMSCs質(zhì)量評價規(guī)范時，首先應(yīng)建立滿足hMSCs綜合質(zhì)量要求、保障其制備工藝的質(zhì)量和穩(wěn)定性所需的質(zhì)量評價規(guī)范，即“質(zhì)量檢驗(yàn)”。這一評價規(guī)范是由《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制和臨床前研究指導(dǎo)原則（試行）》（2015）所規(guī)定的，用于“臨床研究”備案申報所需的綜合質(zhì)量評價規(guī)范。“質(zhì)量檢驗(yàn)”是以一定數(shù)量（來源）批次的終末制劑為評價對象，針對“四大類”質(zhì)量屬性，在質(zhì)量控制技術(shù)選擇上以確證性評價技術(shù)為主的評價規(guī)范。在“質(zhì)量檢驗(yàn)”的基礎(chǔ)上，可建立針對不同階段關(guān)鍵制備工藝的過程控制，和針對不同組織來源批次及生產(chǎn)制備批次的中間細(xì)胞形態(tài)和終末制劑標(biāo)準(zhǔn)放行的評價規(guī)范，即“放行檢驗(yàn)”。同時，為借助第三方評價機(jī)構(gòu)驗(yàn)證和強(qiáng)化自身研發(fā)能力，或?yàn)闈M足不同管理/監(jiān)管需求，可在“質(zhì)量檢驗(yàn)”和“放行檢驗(yàn)”的基礎(chǔ)上，建立不同形式的“復(fù)核檢驗(yàn)”評價規(guī)范。這種“質(zhì)量檢驗(yàn)”-“放行檢驗(yàn)”-“復(fù)核檢驗(yàn)”體系，和在這一體系下所衍生出的其他類型的評價規(guī)范，理論上可滿足不同質(zhì)量目標(biāo)和管理目標(biāo)所需的質(zhì)量要求。在建立和實(shí)踐hMSCs評價體系、評價規(guī)范時，需充分考慮所有hMSCs制劑/制品中共性的和具體制劑/制品的特殊性質(zhì)量要求，首先需滿足同性質(zhì)量評價要求。hMSCs“質(zhì)量檢驗(yàn)”中共性的評價內(nèi)容，包括細(xì)胞表面標(biāo)志物分析、活性、STR圖譜分析、種屬鑒別和種屬間細(xì)胞交叉污染、染色體核型分析、細(xì)菌/真菌/支原體/病毒、內(nèi)毒素、成瘤性、異常免疫反應(yīng)、牛血清殘留、多向分化潛能（以成骨、成脂和成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化為主）、免疫調(diào)控功能（包括對淋巴細(xì)胞增殖抑制、對Th1/Th17/Treg淋巴細(xì)胞亞群的調(diào)控，和抑制TNF釋放），等等。在共性質(zhì)量要求和質(zhì)量評價的基礎(chǔ)上，每一hMSCs制劑的研發(fā)者還應(yīng)根據(jù)其制劑制備工藝的特殊性和臨床適應(yīng)癥的特殊性，開展相關(guān)質(zhì)量研究和建立針對特殊性質(zhì)量屬性的質(zhì)量控制技術(shù)。其中，基因修飾工藝可能對hMSCs自身的生物學(xué)特性影響較大，工藝中所使用的質(zhì)粒DNA、病毒等都可能部分地改變宿主細(xì)胞基因組結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，進(jìn)而可能導(dǎo)致多種潛在的hMSCs生物學(xué)安全性問題，質(zhì)粒DNA和病毒殘留對受試者也可能形成潛在安全性隱患。因此，應(yīng)對特殊制備工藝，特別是基因修飾對細(xì)胞質(zhì)量屬性的影響進(jìn)行深入研究，并建立有效的評價技術(shù)和合理的評價規(guī)范對其進(jìn)行有效控制。同時，還應(yīng)對特殊工藝處理所預(yù)期達(dá)到的新的生物學(xué)有效性質(zhì)量屬性、穩(wěn)定性，和對其他生物學(xué)有效性的影響進(jìn)行驗(yàn)證和評價。3.3“通用型”hMSCs的“質(zhì)量檢驗(yàn)”“通用型”hMSCs是指在整個制備工藝過程中，只是通過常規(guī)組織獲取、細(xì)胞分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增、凍存、復(fù)蘇等基本操作所獲得，未經(jīng)任何特殊處理，并具有hMSCs基本的生物學(xué)有效性和多種臨床適應(yīng)癥治療潛能的hMSCs細(xì)胞。具體評價內(nèi)容可參考表1的內(nèi)容。表1.完整版“通用型”hMSCs“質(zhì)量檢驗(yàn)”的內(nèi)容。P5，P5+X，P5+X+Y分別代表初始檢測代次（或臨床使用代次）、初始代次后的X個擴(kuò)展代次（如5個代次）、初始代次的X+Y個（Y也可以為5個代次）。★為需要檢測項(xiàng)。檢測項(xiàng)目相同組織來源批次細(xì)胞P5P5+XP5+X+Y1．細(xì)胞鑒別1.1細(xì)胞形態(tài)★★★1.2同工酶法★★1.3STR圖譜鑒別★★1.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物★★★1.5種屬間細(xì)胞污染檢測★★1.6染色體核型檢測★2．細(xì)菌、真菌檢測★★★3．支原體檢測3.1培養(yǎng)法★★★3.2DNA熒光染色★★★4．細(xì)胞內(nèi)、外病毒因子檢測 4.1細(xì)胞培養(yǎng)直接觀察法★★★4.2體外不同傳代細(xì)胞培養(yǎng)及血吸附/血凝試驗(yàn)★★4.3動物體內(nèi)接種法1）乳鼠腦內(nèi)及腹腔接種★★2）小鼠腦內(nèi)及腹腔接種★★3）豚鼠腹腔接種★★4）家兔皮內(nèi)及皮下接種★★4.4雞胚接種檢測1）雞胚卵黃囊腔接種★★2）雞胚尿囊腔接種及尿囊液血凝試驗(yàn)★★4.5特殊人源病毒檢測HIV/HBV/HCV/HCMV/EBV/HPV/HHV檢測★4.6牛源病毒檢測★4.7豬細(xì)小病毒檢測★4.8逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測★★5.免疫學(xué)反應(yīng)檢測5.1淋巴細(xì)胞增殖抑制檢測★★★5.2特定淋巴細(xì)胞亞群檢測(Th1\Th17\Treg)★★★5.3淋巴細(xì)胞分泌TNF-α抑制試驗(yàn)★★★6.生物學(xué)有效性評價6.1成骨細(xì)胞分化★★★6.2成軟骨細(xì)胞分化★★★6.3成脂細(xì)胞分化★★★7.細(xì)胞活性檢測7.1細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞存活率★★★7.2細(xì)胞生長曲線★★7.3細(xì)胞周期測定★★8.成瘤性檢測8.1裸鼠體內(nèi)接種試驗(yàn)-★8.2軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)★8.3端粒酶活性檢測★★9.殘留物檢測9.1.牛血清白蛋白殘留檢測★9.2.抗生素殘留檢測★可將表1的內(nèi)容視為可服務(wù)于兩種管理模式的“完整版”評價內(nèi)容。也可以設(shè)計一種單純滿足“臨床研究”備案需要的“精簡版”“質(zhì)量檢驗(yàn)”。所建議的“精簡版”評價內(nèi)容可參見表2。需要強(qiáng)調(diào)的是，“精簡版”評價內(nèi)容的選擇，必須基于對hMSCs科學(xué)性的深刻認(rèn)識以及持續(xù)質(zhì)量研究成果的總結(jié)，和對完成管理目標(biāo)和提高管理效率的充分認(rèn)識。表2.精簡版“通用型”hMSCs“質(zhì)量檢驗(yàn)”的內(nèi)容。P5和P5+X分別代表初始檢測代次（或臨床使用代次）、初始代次后的X個擴(kuò)展代次（如5個代次）?！铮簽樾枰獧z測項(xiàng)。檢測項(xiàng)目相同組織來源批次細(xì)胞P5P5+X1．細(xì)胞鑒別1.1細(xì)胞形態(tài)★★1.2STR圖譜鑒別★★1.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物★★1.4種屬間細(xì)胞污染檢測★★2．細(xì)菌、真菌檢測★★3．支原體檢測3.1培養(yǎng)法★★3.2DNA熒光染色★★4．細(xì)胞內(nèi)、外病毒因子檢測 4.1細(xì)胞培養(yǎng)直接觀察法★★4.2體外不同傳代細(xì)胞培養(yǎng)及血吸附/血凝試驗(yàn)★★4.3乳鼠腦內(nèi)及腹腔接種★4.4雞胚接種檢測1）雞胚卵黃囊腔接種★2）雞胚尿囊腔接種及尿囊液血凝試驗(yàn)★4.5特殊人源病毒檢測HIV/HBV/HCV/HCMV/EBV/HBV/HHV檢查★4.6牛源病毒檢測★4.7豬細(xì)小病毒檢測★4.8逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測★5.免疫學(xué)反應(yīng)檢測5.1淋巴細(xì)胞增殖抑制檢測★★5.2特定淋巴細(xì)胞亞群檢測(Th1\Th17\Treg)★★5.3淋巴細(xì)胞分泌TNF-α抑制試驗(yàn)★★6.生物學(xué)有效性評價6.1成骨細(xì)胞分化★★6.2成脂細(xì)胞分化★★7.細(xì)胞活性檢測7.1細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞存活率★★7.2細(xì)胞生長曲線★7.3細(xì)胞周期測定★8.成瘤性檢測8.2軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)★8.3端粒酶活性檢測★★9.殘留物檢測9.1.牛血清白蛋白殘留檢測★9.2.抗生素殘留檢測★3.4“通用型”hMSCs的“放行檢驗(yàn)”在以工藝驗(yàn)證為目的的‘質(zhì)量檢驗(yàn)’基礎(chǔ)上，hMSCs制劑的研發(fā)者應(yīng)根據(jù)其制劑工藝的特點(diǎn)，和不同階段細(xì)胞質(zhì)量的關(guān)聯(lián)性，設(shè)計用于不同關(guān)鍵制備工藝階段質(zhì)量控制和產(chǎn)品放行的“放行檢驗(yàn)”評價規(guī)范。對于建有細(xì)胞庫的hMSCs，其關(guān)鍵制備工藝應(yīng)包括各細(xì)胞庫的制備，種子細(xì)胞制備、主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫制備，以及制劑制備，并依據(jù)不同階段質(zhì)量要求的關(guān)聯(lián)性，設(shè)計各關(guān)鍵工藝階段的“放行檢驗(yàn)”。3.4.1.hMSCs細(xì)胞庫的“放行檢驗(yàn)”內(nèi)容待完善3.4.2.hMSCs制劑的“放行檢驗(yàn)”內(nèi)容待完善四、hMSCs質(zhì)量評價規(guī)范與干細(xì)胞“類雙軌制”管理模式的關(guān)聯(lián)性內(nèi)容待完善致謝感謝中國食品藥品檢定研究院細(xì)胞資源保藏研究中心研究人員：納濤、張可華、韓曉燕、張麗霞、吳婷婷、陳平、王盼、閆占海、李欣、牟春琳、李學(xué)家、趙楠等同志在本研究工作中的貢獻(xiàn)。感謝國家重點(diǎn)研發(fā)計劃(2016YFA0101501)和中國科學(xué)院干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)(XDA-01030508，XDA01030506)對本研究工作的支持。參考文獻(xiàn)[1] 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袁寶珠,中國干細(xì)胞臨床研究、監(jiān)管體系的現(xiàn)狀及“十三五”期間的戰(zhàn)略考慮.《再生醫(yī)學(xué)：轉(zhuǎn)化與應(yīng)用》（主編：付小兵、王正國、吳祖澤）,2017.[26] 袁寶珠，第二十五章：干細(xì)胞產(chǎn)品的質(zhì)量控制.《生物技術(shù)藥物研究開發(fā)和質(zhì)量控制》（第三版）（主編:王軍志）,2018,科學(xué)出版社,962-89.[27] 樊金萍,袁寶珠.用于鑒別猴源細(xì)胞及其交叉污染短串聯(lián)重復(fù)序列圖譜分析方法的建立.中國生物制品學(xué)雜志,2018.31(8):874-81.名詞解釋人間充質(zhì)干細(xì)胞(Humanmesenchymalstemcells，hMSCs)人間充質(zhì)干細(xì)胞是一類存在于成人、胎兒各組織及胎兒附屬組織中的具有一定程度的自我更新能力、分化潛能、獨(dú)特的免疫調(diào)控功能和組織再生功能的成體干細(xì)胞，具有廣泛的臨床應(yīng)用價值。干細(xì)胞質(zhì)量屬性(Qualityattributes)干細(xì)胞的質(zhì)量屬性是決定干細(xì)胞產(chǎn)品臨床應(yīng)用的安全性和有效性的所有質(zhì)量要素的總和，其內(nèi)容是由干細(xì)胞的科學(xué)屬性和干細(xì)胞產(chǎn)品整個制備過程中所涉及的各種風(fēng)險因素綜合考慮而確定的。干細(xì)胞質(zhì)量屬性可歸納為基本生物學(xué)屬性、微生物學(xué)安全性、生物學(xué)安全性和生物學(xué)有效性?；旧飳W(xué)屬性(Generalbiologicalattributes)也稱基本細(xì)胞生物學(xué)屬性，是指干細(xì)胞基本細(xì)胞生物學(xué)特性中，與細(xì)胞質(zhì)量密切相關(guān)的各質(zhì)量屬性的總和，用于綜合準(zhǔn)確反映相關(guān)細(xì)胞的鑒別、活性、純度和均一性等質(zhì)量屬性。微生物學(xué)安全性(Microbiologysafety)干細(xì)胞的微生物學(xué)安全性是指所有干細(xì)胞產(chǎn)品都應(yīng)滿足無菌（真菌及細(xì)菌）、支原體、病毒及相關(guān)微生物代謝產(chǎn)物污染的質(zhì)量要求。生物學(xué)安全性(Biologicalsafety)干細(xì)胞生物學(xué)安全性是指由干細(xì)胞生物學(xué)特性所決定的風(fēng)險因素所引起的安全性問題，相關(guān)生物學(xué)特性可能導(dǎo)致干細(xì)胞進(jìn)入受試者體內(nèi)可產(chǎn)生成瘤性、促瘤性、異常免疫反應(yīng)、異常分化、異位遷移或異位停留等生物學(xué)安全性問題。生物學(xué)有效性(Biologicaleffectiveness)干細(xì)胞生物學(xué)有效性是臨床前研究階段所表現(xiàn)出的，與其臨床治療效應(yīng)密切相關(guān)的各種生物學(xué)特性的總和，是在臨床前研究階段用于預(yù)測干細(xì)胞臨床治療效應(yīng)的重要質(zhì)量屬性。細(xì)胞鑒別(Identification)是指細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)（包括個體遺傳學(xué)、種屬遺傳學(xué)）、表面標(biāo)志物、特定基因表達(dá)，以及特定生物學(xué)功能等細(xì)胞特性的總和。對細(xì)胞鑒別特性進(jìn)行評價，可用于鑒別細(xì)胞的個體來源、種屬間細(xì)胞交叉污染或同種屬間非相關(guān)細(xì)胞的交叉污染、細(xì)胞純度和均一性等質(zhì)量屬性。分化能力(Differentiationpotential)分化能力主要是指在體外特定誘導(dǎo)分化培養(yǎng)條件下，細(xì)胞向多種預(yù)設(shè)目標(biāo)細(xì)胞分化的功能。不同組織來源的人間充質(zhì)干細(xì)胞具有向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等中胚層細(xì)胞，以及肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等其他胚層細(xì)胞分化的能力。間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)控功能(Immunomodulatoryactivities)間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)控功能主要是指在體外評價體系中所表現(xiàn)出的，對由不同刺激所激活的免疫反應(yīng)的抑制能力，如對促炎性的免疫細(xì)胞增殖或活性的抑制能力，和對抑制性免疫細(xì)胞或調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞增殖或極化的促進(jìn)能力，以及自身可釋放不同類型免疫調(diào)節(jié)分子的能力。這些免疫調(diào)控功能也是間充質(zhì)干細(xì)胞治療各類臨床適應(yīng)癥的關(guān)鍵細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制。間充質(zhì)干細(xì)胞組織再生功能(Regenerativeactivities)是指不同組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞所具有的保護(hù)組織細(xì)胞抗凋亡功能、促進(jìn)病損組織血管再生功能、刺激促炎性的巨噬細(xì)胞向抑制炎性的巨噬細(xì)胞極化，刺激病損周邊正常組織細(xì)胞代償性增殖或反分化，以及促進(jìn)內(nèi)源性病損組織中的干細(xì)胞增殖和分化等所有生物學(xué)功能的總和，其綜合結(jié)果是促進(jìn)病損組織修復(fù)甚或組織再生。成瘤性(Tumorigenicity)細(xì)胞接種到免疫缺陷動物體內(nèi)后在注射部位和（或）轉(zhuǎn)移部位由接種細(xì)胞所形成腫瘤的能力。質(zhì)量檢驗(yàn)(QualityTest)是《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則（試行）》中所規(guī)定的，為確保干細(xì)胞治療的安全性、有效性和質(zhì)量可控性，以多個不同來源批次的干細(xì)胞制劑為評價對象，以完整的質(zhì)量屬性為評價對象，以制備工藝的質(zhì)量及穩(wěn)定性為評價目標(biāo)所進(jìn)行的全面質(zhì)量評價方式或評價規(guī)范。放行檢驗(yàn)(Releasetest)是在完成整個細(xì)胞制備工藝驗(yàn)證的基礎(chǔ)上，根據(jù)各階段工藝的特性和特定階段細(xì)胞的質(zhì)量要求，選擇具有代表性的質(zhì)量屬性作為評價內(nèi)容，以特定生產(chǎn)工藝階段的細(xì)胞為評價對象，以具有替代性的評價技術(shù)為主所進(jìn)行質(zhì)量評價方式或評價規(guī)范。干細(xì)胞放行檢驗(yàn)應(yīng)包括對中間細(xì)胞（如不同級別細(xì)胞庫的細(xì)胞）和終末細(xì)胞制劑的放行檢驗(yàn)。批次(Batch)是細(xì)胞質(zhì)量控制中的重要概念，可分為來源批次和生產(chǎn)工藝批。其中，成體干細(xì)胞的來源批次是指由同一供體、同一組織來源、在同一時間、使用同一工藝采集和分離或建立的細(xì)胞。而生產(chǎn)工藝批次是指由同一來源批次，經(jīng)同一制備工藝所產(chǎn)生的細(xì)胞為同一工藝制備批次。例如，由同一工作庫細(xì)胞在同一時間所制備的終末制劑為同一制備工藝批次的細(xì)胞。對于hESCs，同一來源批次是指由同一供者胚胎所分離和建立的獨(dú)一干細(xì)胞系，而同一制備批次是指由同一hESCs“種子細(xì)胞”在同一時間經(jīng)同一誘導(dǎo)分化技術(shù)所產(chǎn)生的終末分化細(xì)胞制劑為同一制備批次細(xì)胞。代次(Passagenumber)細(xì)胞按照規(guī)定的時間間隔和細(xì)胞比例進(jìn)行常規(guī)的酶消化傳代，每傳代一次視為一個細(xì)胞代次。干細(xì)胞制劑(Stemcell-basedmedicinalproducts)是指經(jīng)完整制備工藝所形成的，與不同成分的輔料相混合并分裝至特定容器，符合特定放行標(biāo)準(zhǔn)，可直接應(yīng)用于臨床受試者的干細(xì)胞產(chǎn)品。中間細(xì)胞產(chǎn)品(Intermediatecellproducts)廣義而言，中間產(chǎn)品是指從最初細(xì)胞采集到形成制劑之間的各種細(xì)胞。而實(shí)際中的中間產(chǎn)品多是指與關(guān)鍵制備工藝相對應(yīng)的細(xì)胞形態(tài)，如主細(xì)胞庫細(xì)胞、工作細(xì)胞庫細(xì)胞等。細(xì)胞庫(Cellbank)