微藻生物柴油技術(shù)發(fā)展與應(yīng)用

微藻生物柴油技術(shù)發(fā)展與應(yīng)用

能源是可持續(xù)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的動(dòng)力，石化燃料資源的日益匱乏給全球經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來了危機(jī)?！吨袊茉窗l(fā)展報(bào)告(2011)》指出:“十一五”期間,中國能源消費(fèi)總量達(dá)到32.5億t標(biāo)準(zhǔn)煤,年均增長6.6%,到2010年已成為世界第一大能源消費(fèi)國。中國原油進(jìn)口量從2005年的1.27億t增加到2010年的1.6億t,對外依存度接近55%。這給我國能源安全帶來了巨大的威脅,因此發(fā)展新型能源具有非常重要的意義。生物質(zhì)能源作為新型能源的典型代表已引起了越來越多科研人員的廣泛關(guān)注。作為生物質(zhì)能源,微藻被認(rèn)為是一種極具潛力的生物柴油原料。微藻具有光合效率高,零凈碳值,細(xì)胞增殖快,生產(chǎn)周期短,所需的培養(yǎng)基來源豐富,所產(chǎn)的油脂成分與植物油類似,并且不與農(nóng)爭地、不與人爭糧、不影響全球能源分配等優(yōu)點(diǎn)。利用微藻生產(chǎn)生物柴油的工藝過程包括微藻的規(guī)模培養(yǎng)、細(xì)胞采收、油脂提取及生物柴油轉(zhuǎn)化等環(huán)節(jié)。其中微藻油脂的提取是影響微藻生物柴油技術(shù)產(chǎn)業(yè)化和生產(chǎn)成本的關(guān)鍵步驟之一。本文對近10年來微藻油脂制取過程中藻種的選擇、微藻細(xì)胞破壁方法以及微藻油脂提取技術(shù)方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。1富油微藻細(xì)胞油脂含量高的優(yōu)良藻種是有效提取微藻油脂的前提。眾多科研人員研究發(fā)現(xiàn),油脂含量較高的微藻主要集中在綠藻、硅藻、金藻等真核微藻。常見的富油微藻主要有葡萄藻(綠藻)、小球藻(綠藻)、杜氏藻(綠藻)、三角褐指藻(硅藻)等。在某些情況下,尤其是逆境條件下(如氮短缺等),這些微藻細(xì)胞會(huì)大量積累油脂,主要是甘油三酯(葡萄藻則是積累烴類油脂)。常見富油微藻藻種的油脂含量如表1所示。2藻細(xì)胞油脂提取法由于微藻油脂大多存在于藻體細(xì)胞內(nèi),而且部分油脂以與蛋白質(zhì)或糖類結(jié)合的脂蛋白或脂多糖的形式存在,藻體細(xì)胞被較為堅(jiān)韌的細(xì)胞壁所包裹,較難直接將油脂提取出來。因此,在油脂提取前需要對藻體進(jìn)行破壁預(yù)處理。常見的預(yù)處理方法主要分為物理、化學(xué)和生物化學(xué)破壁法。2.1反復(fù)凍融法破碎細(xì)胞的研究微藻的物理破壁法主要包括高壓均質(zhì)法、研磨法、反復(fù)凍融法、超聲波破壁法、微波破壁法以及脈沖電場破壁法。高壓均質(zhì)是指微藻細(xì)胞在通過工作閥的過程中,在高壓下產(chǎn)生強(qiáng)烈的剪切、撞擊、空穴和湍流渦作用,從而使細(xì)胞得到破碎。在此過程中細(xì)胞的破碎程度與所用壓力、微藻細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞大小有關(guān)。Halim等在壓力為85MPa條件下對Chlorococcumsp.微藻進(jìn)行高壓均質(zhì)破壁處理,細(xì)胞破碎率達(dá)到73.8%。采用高壓均質(zhì)具有破壁率高的特點(diǎn),但所耗的能量較大,是一種能源密集型技術(shù)。研磨法是一種機(jī)械破壁方法,其原理是將微藻細(xì)胞與研磨劑(小珠)混合,通過高速研磨或攪拌,使微藻細(xì)胞與堅(jiān)硬的研磨劑充分接觸,從而達(dá)到破壁的效果。Zheng等將Chlorellavulgaris微藻與0.4~0.6mm的玻璃珠研磨劑混合,在旋轉(zhuǎn)速度1500r/min的條件下破壁300min,Chlorellavulgaris微藻油脂的提取率達(dá)到10%,表明該法對微藻細(xì)胞有一定的破碎效果。Halim等在對微藻破壁方法的研究中發(fā)現(xiàn),采用研磨法可使Chlorococcumsp.微藻平均細(xì)胞破碎率達(dá)到17.5%。研磨法通常與有機(jī)溶劑提取法結(jié)合使用,當(dāng)微藻細(xì)胞濃度高且提取產(chǎn)物易于分離時(shí),采用研磨法是一種經(jīng)濟(jì)有效的預(yù)處理手段。反復(fù)凍融法破碎細(xì)胞主要是利用細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成和細(xì)胞液濃度增高引起溶脹。每次凍融在細(xì)胞內(nèi)外形成冰晶的部位不一樣,這樣就能對細(xì)胞不同部位的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生破壞,因而多次凍融能使破碎效果提高。陳偉平等利用反復(fù)凍融法對紫球藻、薔薇藻和念珠藻3種藻細(xì)胞進(jìn)行破碎,結(jié)果表明紫球藻和薔薇藻經(jīng)反復(fù)凍融細(xì)胞破碎率高。Soni等采用反復(fù)凍融法提取四點(diǎn)顫藻藻膽蛋白,研究表明4次凍融可以提取出胞內(nèi)大部分藻膽蛋白。王雪青等采用反復(fù)凍融法破碎17種微藻細(xì)胞,通過細(xì)胞破碎率檢測破碎效果,結(jié)果表明經(jīng)過2次凍融,10種微藻的破碎率在95%以上,4種在60%~80%,破碎效果與微藻細(xì)胞的種類、細(xì)胞壁組成等因素密切相關(guān)。反復(fù)凍融法具有方便、對熱敏性物質(zhì)沒有損害、不受外源性雜質(zhì)污染等優(yōu)勢,因而應(yīng)用廣泛。超聲波破壁法是一種適合大多數(shù)藻細(xì)胞的破壁方法,其原理是超聲波能夠?qū)γ劫|(zhì)產(chǎn)生獨(dú)特的機(jī)械振動(dòng)作用和空化作用。當(dāng)超聲波振動(dòng)時(shí)能產(chǎn)生并傳播強(qiáng)大的能量,在液體中還會(huì)發(fā)生空化作用使其在液體內(nèi)形成空化泡,若空化泡在微藻細(xì)胞壁附近破裂,就會(huì)破壞微藻細(xì)胞壁,使胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來。超聲波對細(xì)胞破碎的效率與細(xì)胞種類、時(shí)間、細(xì)胞濃度和超聲波的聲頻、聲能有關(guān)。裴海燕等在研究藻細(xì)胞破碎對釋放有機(jī)物特性的研究中發(fā)現(xiàn),超聲處理確實(shí)增加了微藻細(xì)胞內(nèi)有機(jī)物的釋放。孫利芹等研究了超聲波對紫球藻的破碎效果,結(jié)果表明當(dāng)輸出功率150W、處理時(shí)間20min時(shí),破碎率達(dá)到85%。王雪青等采用超聲波法破碎17種微藻細(xì)胞,細(xì)胞破碎結(jié)果顯示,經(jīng)過12min的超聲波處理,所有實(shí)驗(yàn)藻種的破碎率均在90%以上。超聲波法具有破壁率高、處理時(shí)間短、對環(huán)境無污染等優(yōu)點(diǎn),但目前超聲波處理對所提油脂品質(zhì)的影響還不很清楚且很難應(yīng)用到大規(guī)模生產(chǎn)中。微波破壁法的原理是微波加熱導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的極性物質(zhì)尤其是水分子吸收微波能,產(chǎn)生大量的熱量,使胞內(nèi)溫度迅速上升,液態(tài)水汽化產(chǎn)生的壓力將細(xì)胞膜和細(xì)胞壁沖破,形成微小的孔洞;進(jìn)一步加熱,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部和細(xì)胞壁水分減少,細(xì)胞收縮,表面出現(xiàn)裂紋。Lee等用微波法對微藻原料進(jìn)行預(yù)處理后提取微藻中的油脂,研究表明微波法是一種簡單可行的預(yù)處理方法。Zheng等采用微波法對Chlorellavulgaris微藻進(jìn)行破壁處理,研究表明微波破壁具有較好的破壁效果。微波破壁具有安全、快速等優(yōu)點(diǎn),但由于微波法能使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量熱量,因此采用微波預(yù)處理可能會(huì)對所提油脂的品質(zhì)產(chǎn)生不良影響。脈沖電場破壁法是利用高壓脈沖電穿孔機(jī)理,在瞬間使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜發(fā)生破壞。脈沖電場破壁法具有耗能少、處理時(shí)間短、不易引起蛋白質(zhì)和核酸變性等優(yōu)點(diǎn),是一種新型的微藻破壁技術(shù)。目前,該技術(shù)運(yùn)用于藻油提取的報(bào)道較少,但脈沖電場技術(shù)是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ奈⒃迤票诩夹g(shù)。2.2酶法細(xì)胞破碎法微藻的化學(xué)與生物化學(xué)破壁法主要包括酸熱法、化學(xué)滲透法、酶溶法等。酸熱法是將微藻細(xì)胞與酸加熱共煮一定時(shí)間,從而使細(xì)胞壁酸解破裂。Halim等在對微藻破壁方法的研究中發(fā)現(xiàn),將Chlorococcumsp.微藻與8%的硫酸在160℃條件下共煮45min,可使微藻細(xì)胞的破壁率達(dá)到33.2%?；瘜W(xué)滲透法則是使用有機(jī)溶劑或無機(jī)溶液來改變細(xì)胞壁的通透性,達(dá)到破壁效果。此法較為溫和,但操作時(shí)間較長。陳偉平等利用低濃度氯化鈣溶液對紫球藻、薔薇藻和念珠藻3種藻細(xì)胞進(jìn)行破碎,研究表明低濃度氯化鈣對3種微藻都有一定的破壁效果,其中對念珠藻的破壁效果最明顯。酶溶法通過各種水解酶將細(xì)胞壁分解,酶法細(xì)胞破碎技術(shù)不僅能提高胞內(nèi)產(chǎn)物的提取效率、降低能耗,還能減少化學(xué)試劑的用量,有利于環(huán)保。何擴(kuò)等在小球藻破壁技術(shù)的研究中發(fā)現(xiàn),纖維素酶單獨(dú)作用的最佳酶量為2%,復(fù)合酶作用的最佳酶量為1%。姜?jiǎng)︿h等對寇氏隱甲藻進(jìn)行破壁研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶法破壁后能夠提高微藻油脂的提取率,把酶法破壁和超聲波法破壁結(jié)合起來,破壁率可高達(dá)91.7%。Zheng等采用酶解法對Chlorellavulgaris微藻進(jìn)行破壁處理,發(fā)現(xiàn)酶解法的破壁效果明顯優(yōu)于研磨法等機(jī)械破壁方法。采用化學(xué)與生物化學(xué)破壁法具有破壁率高、能耗低等優(yōu)點(diǎn),但由于化學(xué)與生物化學(xué)破壁法需要引入化學(xué)試劑或酶制劑,在一定程度上會(huì)增加后期生產(chǎn)過程中產(chǎn)物分離與提純的困難。3微藻細(xì)胞內(nèi)的油脂的提取微藻細(xì)胞采用某些破壁方法預(yù)處理后,大部分油脂仍貯留在細(xì)胞內(nèi),需采用合適的方法將微藻細(xì)胞內(nèi)的油脂進(jìn)一步提取出來。目前常用的微藻油脂提取方法主要有:有機(jī)溶劑提取法、超臨界萃取法、亞臨界溶劑法以及耦合提取技術(shù)等。3.1微藻油脂的提取有機(jī)溶劑提取法是目前國內(nèi)外廣泛應(yīng)用的微藻油脂提取技術(shù)。該技術(shù)應(yīng)用固液萃取的原理,選用某種能夠溶解油脂的有機(jī)溶劑,經(jīng)過對微藻的接觸(包括浸泡或噴淋等)使微藻油脂溶解在選定的溶劑中而被萃取出來。對選用的有機(jī)溶劑通常有以下幾個(gè)要求:對油脂有較好溶解度、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、容易與油脂分離、安全性能好。實(shí)驗(yàn)室常用的提取溶劑主要有石油醚、正己烷、丙酮、氯仿、乙醇和甲醇等,也可利用混合溶劑提取微藻油脂。Ranjan等采用索氏提取法和Bligh-Dyer法提取微藻油脂,得出的結(jié)論是微藻油脂提取的機(jī)制是細(xì)胞擴(kuò)散,并且發(fā)現(xiàn)溶劑的選擇是影響微藻細(xì)胞中油脂擴(kuò)散的主要因素。劉群等以石油醚/乙醚為溶劑提取球等鞭金藻海藻油,通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定最佳提取工藝,得到的油脂提取率約為40.8%。劉圣臣等以小球藻為原料,采用乙醇作為溶劑提取海藻油,在最佳工藝條件下出油率達(dá)到24.28%。Hemanathan等利用正己烷提取海洋微藻中的油脂,油脂提取率為(45±4)%。日本電力工業(yè)中央研究院(CRIEPI)于2010年宣布了一種采用液化二甲醚在常溫下有效提取海藻油的方法。該方法利用液化二甲醚能夠與水和油混合的獨(dú)特性,在室溫下對海藻同時(shí)進(jìn)行脫水和提油。與傳統(tǒng)方式相比,不僅可減少脫水和干燥需要的能量,還可以減少所需的有機(jī)溶劑用量。此外,微藻油脂的提取還可采用直接皂化法和直接酯化法。直接皂化法即原料直接與醇堿溶液(KOH-CH3OH或KOH-C2H5OH)反應(yīng)提取,該方法提取快速、簡便,但脂肪酸的提取率比較低;直接酯化法是指原料與酯化試劑(乙酰氯或三氟化硼的醇溶液)進(jìn)行酯交換,提取率較高,但酯化試劑通常毒性較大。采用有機(jī)溶劑法提取微藻中的油脂具有出油率高、容易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模和自動(dòng)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn),但由于有機(jī)溶劑通常具有揮發(fā)性和毒性,不利于人體健康和環(huán)保。因此,如何在微藻油脂提取過程中減少有機(jī)溶劑的使用已成為近年來的研究熱點(diǎn)。3.2超臨界流體萃取超臨界萃取技術(shù)是近二三十年發(fā)展起來的一種新型分離技術(shù),在超臨界狀態(tài)下,利用超臨界流體具有的優(yōu)良溶解性及這種溶解性隨溫度和壓力變化而變化的原理,將超臨界流體與待分離的物質(zhì)接觸,使其選擇性地把不同極性大小、沸點(diǎn)高低和相對分子質(zhì)量大小的成分依次萃取出來,借助減壓、升溫的方法使超臨界流體變成普通氣體,被萃取物質(zhì)則完全或基本析出,從而達(dá)到分離提純的目的。超臨界流體萃取過程是由萃取和分離兩個(gè)過程組合而成的,一般用CO2作為萃取劑萃取油脂。超臨界萃取的效果與壓力、萃取溫度、CO2流速以及萃取時(shí)間有關(guān)。程霜等確定了螺旋藻油超臨界CO2萃取的最佳工藝條件:萃取壓力25MPa,萃取溫度40℃,萃取時(shí)間2h,在此條件下螺旋藻油的萃取率為95.3%。Andrich等研究了超臨界萃取微綠球藻的動(dòng)力學(xué)過程,在萃取條件55MPa,萃取溫度40℃條件下,油脂提取率約為250mg/g。在超臨界萃取過程中,加入少量乙醇作輔助溶劑,可以提高CO2的溶解度,降低萃取所需的溫度與壓力,達(dá)到更好的萃取效果。Mendes等用乙醇作輔助溶劑,采用超臨界萃取法提取Arthrospira微藻中的油脂,發(fā)現(xiàn)油脂提取率與Bligh-Dyer法相當(dāng)。超臨界萃取法具有操作溫度低、提油率高、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn),但是所需設(shè)備昂貴、提油過程耗能大、對操作條件要求高。3.3在微擬生物原料的萃取中的應(yīng)用亞臨界溶劑提取技術(shù)是一種新的加速萃取技術(shù),其原理是將樣品置于密閉容器中加溫加壓,通過升高壓力提高溶劑的沸點(diǎn),使溶劑在高于正常沸點(diǎn)的溫度下仍處于液態(tài),加速被提取物從原料顆?；|(zhì)中解析并快速進(jìn)入溶劑。Young等利用離子液體萃取酵母和小球藻等生物原料的油脂,在離子液體中添加甲醇、乙酸、丙酮、氯仿等溶劑,使原來的萃取體系成為共溶劑體系,油脂萃取效率得到了顯著提高。李植峰等在真菌油脂提取實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),在氯仿、甲醇有機(jī)溶劑萃取的基礎(chǔ)上加入酸,能大大縮短樣品的處理時(shí)間,且油脂提取率優(yōu)于超臨界CO2萃取法。陳閩等用不同亞臨界溶劑從微擬球藻濕藻泥中提取油脂,結(jié)果表明亞臨界乙醇-正己烷溶劑對濕藻細(xì)胞有較高的油脂萃取率且消耗的溶劑少,若加入少量硫酸可進(jìn)一步提高油脂的提取率,降低溶劑用量。由此可見,亞臨界溶劑法提取微藻中的油脂具有速度快、所耗有機(jī)溶劑少、提油率高等優(yōu)點(diǎn)。3.4聯(lián)合法提取微藻油耦合法提取微藻油脂主要包括:超聲輔助提取法、微波輔助提取法、脈沖電場輔助提取法以及酶提取法等微藻油脂提取技術(shù)。3.4.1利用科技強(qiáng)化提取超聲輔助提取法是指利用超聲波的熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng),強(qiáng)化溶劑提取過程,達(dá)到縮短提取時(shí)間,減少溶劑用量,提高油脂提取率的目的,是一種具有發(fā)展?jié)摿Φ睦猛饬鰪?qiáng)化提取的新技術(shù)。盧群等采用超聲輔助提取小球藻(Chlorellasp.)中的油脂,結(jié)果表明利用超聲波強(qiáng)化溶劑提取過程可縮短提取時(shí)間、提高溶劑利用率、減少溶劑用量、提高提油率。Cravotto等采用超聲輔助溶劑法提取Crypthecodiniumcohnii微藻中的油脂,可以將油脂提取率從4.8%(索氏抽提法)提高到25.9%。3.4.2脂提取率的提取微波輔助提取法是指利用微波的熱效應(yīng),在對微藻細(xì)胞進(jìn)行破壁的同時(shí),強(qiáng)化有機(jī)溶劑提取過程,達(dá)到縮短提取時(shí)間,減少溶劑用量,提高油脂提取率的目的。Cravotto等采用微波輔助法提取Crypthecodiniumcohnii微藻中的油脂,可以將油脂提取率從4.8%(索氏抽提法)提高到17.8%。Balasubramanian等采用微波輔助法提取Scenedesmusobliquus微藻中的油脂,提取率從47%(索氏抽提法)提高至77%,提取時(shí)間從10h縮短至20min,且提取的油脂質(zhì)量較好。3.4.3微藻油脂的提取高壓脈沖電場是一種新型的非熱加工技術(shù),利用高壓脈沖電穿孔機(jī)理可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜的穿孔作用,對于提取細(xì)胞內(nèi)的成分具有很好的作用效果。目前已經(jīng)有不少報(bào)道將該技術(shù)應(yīng)用于玉米油、大豆油、橄欖油等植物油的提取過程中,是一種具