三葉抗流感膠囊抗甲型h1n1流感病毒的研究

三葉抗流感膠囊抗甲型h1n1流感病毒的研究

流行感染（感染）是流感病毒引起的呼吸道感染，通常急性發(fā)作和傳染性物質(zhì)。主要經(jīng)呼吸道飛沫迅速傳播,人群普遍易感,流感抗原容易變異,難于控制。臨床表現(xiàn)來(lái)看為發(fā)熱、全身乏力、鼻塞流鼻涕等癥狀。我國(guó)多見(jiàn)于18歲以下兒童及青少年,發(fā)達(dá)國(guó)家好發(fā)于青壯年。一葉抗流感膠囊是中藥組方,臨床主要用于治療流感,曾用名和劑型為金蒿抗流感滴丸,由新疆一枝蒿和貫葉金絲桃兩味傳統(tǒng)藥材經(jīng)現(xiàn)代工藝制成的復(fù)方制劑,其中有效成分一枝蒿酮酸和金絲桃苷?qǐng)?bào)道有利尿、咳嗽、解痙、降低血壓、降低膽固醇、鎮(zhèn)痛和保護(hù)心血管等作用。研究發(fā)現(xiàn)該方劑在體內(nèi)外均具有明顯的抗流感病毒、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和抑菌的作用。本研究體內(nèi)采用兩株甲型流感病毒(H1N1亞型FM1株和PR8株)感染小鼠造成病毒性肺炎模型,觀察一葉抗流感膠囊治療性給藥和預(yù)防性給藥對(duì)小鼠病毒性肺炎的抑制作用,觀察其對(duì)小鼠生存天數(shù)和死亡率的影響;體外CPE法觀察一葉抗流感膠囊對(duì)流感病毒FM1、PR8感染犬腎上皮細(xì)胞(MDCK)的作用。1材料表面1.1重41gICR小鼠(SPF/VAF級(jí)),體重(14±1)g,雌雄不限。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,動(dòng)物合格證SCXK(京)2006-0009。1.2病毒病控制實(shí)驗(yàn)甲型H1N1流感病毒鼠肺適應(yīng)株(FM/1/47株和PR/8/34株),購(gòu)自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制研究所,由本生物安全實(shí)驗(yàn)室(ABSL-2)雞胚傳代,TCID50分別為10-4.5,10-4,-80℃保存?zhèn)溆谩?.3細(xì)胞MDCK,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院細(xì)胞中心,本室傳代液氮凍存。1.4cumperfratum兩味藥材的相關(guān)問(wèn)題一葉抗流感膠囊,是由新疆一枝蒿ArtemsiarupestrisL.和貫葉金絲桃Hypericumperforatum兩味藥材按質(zhì)量1∶1經(jīng)乙醇提取,大孔吸附樹(shù)脂純化得到,藥材鑒定人為黃華研究員(新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所,專業(yè)為中藥學(xué)),其有效成分為一枝蒿酮酸,得率為38.02%,由新疆西部加斯特藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn),生產(chǎn)批號(hào)20130731,性狀:褐色膠囊內(nèi)容物。1.5四川光計(jì)劃在四川光計(jì)劃設(shè)備公司5.利巴韋林顆粒(四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn),批號(hào)130710),抗病毒顆粒(四川光大制藥有限公司,批號(hào)1302107-017)。1.6細(xì)胞培養(yǎng)液含10%FBS(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品,批號(hào)TBD31HB),DMEM(Gibco,900162)。1.7美國(guó)al.18a2型生物安全柜倒置相差顯微鏡(日本Olympus),CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司),MSC18A2型生物安全柜(美國(guó)Thermo),YP/0001電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司),AR204電子天平(美國(guó)Chaus)。2方法2.1配置方法體內(nèi)試驗(yàn)時(shí)用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC)溶液配制,體外試驗(yàn)用高純水配制、實(shí)驗(yàn)時(shí)用細(xì)胞維持液倍比稀釋。2.2小鼠等效劑量一葉抗流感膠囊人臨床劑量為4.8g·d-1,按70kg算,即68.57mg·kg-1·d-1。小鼠試驗(yàn)用量分別為1.5,0.75,0.38g·kg-1·d-1,分別相當(dāng)于人臨床用藥量的2倍、等倍和1/2倍;利巴韋林臨床用量為450mg·d-1,換算成小鼠等效劑量為0.07g·kg-1;抗病毒顆粒臨床用量為27g·d-1,換算成小鼠等效劑量為4.24g·kg-1,試驗(yàn)時(shí)各藥物按等容積20mL·kg-1ig給藥。2.3小鼠乙流感染fm1小鼠按體重等級(jí)隨機(jī)分為7組,分別為正常對(duì)照組、病毒對(duì)照組、利巴韋林組、抗病毒顆粒組、一葉抗流感膠囊高、中、低3個(gè)劑量組(1.5,0.75,0.38g·kg-1),每組12只。除正常對(duì)照組外,將小鼠用乙醚輕度麻醉,以15個(gè)LD50流感病毒液(FM1和PR8株)滴鼻感染,每只35μL。感染當(dāng)天開(kāi)始給藥,每次按20mL·kg-1ig,1次/d,連續(xù)4d,正常對(duì)照組和病毒對(duì)照組同等條件灌胃給予0.5%CMC。第5天稱體重后解剖稱肺重,計(jì)算肺指數(shù)及肺指數(shù)抑制率。2.4連續(xù)給藥4周小鼠按體重隨機(jī)分為7組,分組方法及給藥方式同2.3,每天1次,連續(xù)4d。最后1次給藥后除正常對(duì)照組外,對(duì)小鼠進(jìn)行感染,感染方法同2.3。感染后不再給藥,感染后第4天,稱取小鼠體重后解剖,全肺稱質(zhì)量,計(jì)算肺指數(shù)及肺指數(shù)抑制率。2.5葉抗氣流膠囊組取小鼠按體重等級(jí)隨機(jī)分為6組,分別為病毒對(duì)照組、利巴韋林組、抗病毒顆粒組、一葉抗流感膠囊高、中、低3個(gè)劑量組,每組20只。以2個(gè)LD50流感病毒液(FM1和PR8株)滴鼻感染,每只35μL。感染當(dāng)天開(kāi)始給藥,連續(xù)4d。觀察感染后2周內(nèi)動(dòng)物的死亡情況,計(jì)算死亡率、死亡保護(hù)率、平均存活天數(shù)和生命延長(zhǎng)率。2.6連續(xù)給藥4周取小鼠按體重等級(jí)隨機(jī)分為6組,分組方法和給藥方式同2.3,每日1次,連續(xù)4天。最后1次給藥后,對(duì)小鼠進(jìn)行感染,感染方法同2.5。觀察死亡情況方法,統(tǒng)計(jì)方法同2.5。2.7mtt法檢測(cè)細(xì)胞毒性將一葉抗流感膠囊藥物母液用培養(yǎng)液做1∶2~1∶256倍比稀釋后,加到已長(zhǎng)成單層的MDCK細(xì)胞培養(yǎng)板中,100μL/孔,每個(gè)稀釋度藥液做4個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。將培養(yǎng)板置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),48h后每孔加入10μLMTT(5g·L-1),37℃培養(yǎng)4h后,小心吸去培養(yǎng)液,加入100μLDMSO,置搖床上震蕩,結(jié)晶物充分溶解后,測(cè)吸光度(A)490nm。找出最大無(wú)毒濃度(TC0),并按Reed-Muench法計(jì)算50%細(xì)胞毒性濃度(TC50)。2.8細(xì)胞病變檢測(cè)取已長(zhǎng)成單層MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)板,分別接種的不同稀釋度的流感病毒液(FM1株10-2.3稀釋度、PR8株10-2稀釋度),每種毒株100μL/孔,置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中吸附1h后,加入TC0及以下的3個(gè)濃度的一葉抗流感膠囊,100μL/孔,同時(shí)設(shè)正常對(duì)照和病毒對(duì)照,并以利巴韋林為陽(yáng)性對(duì)照。置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每日倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況。細(xì)胞病變按6級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判斷:-:細(xì)胞生長(zhǎng)正常,無(wú)病變出現(xiàn);±:細(xì)胞病變少于整個(gè)單層的10%;+:細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的25%以下;ue0d1:細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的50%以下;ue0d2:細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的75%以下;ue0d3:細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的75%以上;當(dāng)病毒對(duì)照組細(xì)胞病變?yōu)閡e0d3時(shí)記錄試驗(yàn)結(jié)果,并按Reed-Muench計(jì)算50%抑制濃度(IC50)和治療指數(shù)(TI),TI=TC50/IC50。2.9肺指數(shù)、平均存管平均存天數(shù)和死亡率試驗(yàn)數(shù)據(jù)以u(píng)e0af±s表示,采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì),肺指數(shù)和平均存活天數(shù)采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),死亡率采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果3.1模型和模型組肺指數(shù)比較流感病毒FM1和PR8株感染小鼠后,病毒對(duì)照組肺指數(shù)明顯增高,與正常對(duì)照組比較有顯著性差異;一葉抗流感膠囊進(jìn)行治療性給藥后,給藥3個(gè)不同劑量組肺指數(shù)均有不同程度降低,其中FM1株高、中、低劑量組及PR8高、中劑量組與模型組比較有顯著性差異。給予一葉抗流感膠囊進(jìn)行預(yù)防性給藥后,3個(gè)劑量組肺指數(shù)均沒(méi)有明顯改變。見(jiàn)表1。3.2對(duì)小鼠的毒力流感病毒FM1株感染正常小鼠2周內(nèi),病毒對(duì)照組動(dòng)物死亡率為90%,平均存活天數(shù)為9.20d;治療性給藥后,3個(gè)劑量組死亡數(shù)均有一定程度的降低,但與模型組比較沒(méi)有顯著性差異;高、中劑量組均能明顯延長(zhǎng)感染小鼠存活天數(shù),與模型組比較具有顯著性差異。PR8株感染2周內(nèi),病毒對(duì)照組動(dòng)物死亡率為90%,平均存活天數(shù)為9.25d;治療性給藥后,高劑量組動(dòng)物的死亡數(shù)明顯降低,與病毒組比較具有顯著性差異(P<0.05);高、中劑量組均能明顯延長(zhǎng)感染小鼠存活天數(shù),與病毒組比較具有顯著性差異(P<0.05)。見(jiàn)表2。3.3對(duì)小鼠的死亡數(shù)影響流感病毒FM1株感染正常小鼠2周內(nèi),病毒對(duì)照組動(dòng)物死亡率為85%,平均存活天數(shù)為9.35d;預(yù)防性給藥后,3個(gè)劑量組動(dòng)物的死亡數(shù)均有一定程度的降低,但與模型組比較沒(méi)有顯著性差異;高、中劑量組能明顯延長(zhǎng)感染小鼠存活天數(shù),與模型組比較具有顯著性差異(表3)。PR8株感染正常小鼠2周內(nèi),病毒組死亡率為55%,平均存活天數(shù)為11.60d;預(yù)防性給藥后,3個(gè)劑量組動(dòng)物的死亡數(shù)、存活天數(shù)均沒(méi)有明顯變化。3.4折光性增加規(guī)則加入一葉抗流感膠囊后,MDCK細(xì)胞變圓或形狀不規(guī)則,折光性增加;培養(yǎng)48h后,用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性,最大無(wú)毒濃度(TC0)為2.5g·L-1,TC50為6.01g·L-1。3.5抗氣流膠囊對(duì)fm1的療效光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)FM1、PR8病毒對(duì)照孔細(xì)胞病變效應(yīng)主要表現(xiàn)為圓縮脫落、少數(shù)畸形、死亡,加入一葉抗流感膠囊后,對(duì)FM1所致細(xì)胞病變有保護(hù)作用,且隨藥物濃度降低病變細(xì)胞有增多趨勢(shì),表現(xiàn)為在體外對(duì)甲型H1N1流感病毒FM1株有不同程度的抑制作用,其IC50均為0.89g·L-1,治療指數(shù)TI為6.75;而對(duì)PR8株無(wú)明顯的抑制作用。4抗氣流膠囊治療整合因子染料對(duì)小鼠肺指數(shù)的影響一葉抗流感膠囊是一種防治甲型流感的推薦用中藥組方,應(yīng)用于臨床具有較好的療效。本研究采用兩株甲型H1N1流感病毒感染小鼠造成病毒性肺炎的動(dòng)物模型和感染易感細(xì)胞MDCK造成體外細(xì)胞模型,在體內(nèi)外對(duì)一葉抗流感膠囊治療流感的作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。采用甲型H1N1流感病毒FM1和PR8病毒株感染正常小鼠后肺指數(shù)明顯增高,較正常對(duì)照組有顯著性差異;感染小鼠2周內(nèi),病毒對(duì)照組動(dòng)物死亡率均為90%,平均存活天數(shù)分別為9.20,9.25d,給予一葉抗流感膠囊治療后能明顯降低流感病毒FM1株和PR8株感染后小鼠的肺指數(shù),對(duì)小鼠肺部炎癥有明顯治療作用,高、中劑量組與模型對(duì)照組比較有顯著性差異;還降低病毒性肺炎小鼠死亡率、其中PR8毒株感染的高劑量組較模型組有顯著性差異,高、中劑量組還可以明顯延長(zhǎng)小鼠的平均存活天數(shù)。中醫(yī)書(shū)籍中早已有了瘟疫“治未病、未病先防”的史料記載,強(qiáng)調(diào)預(yù)防重于治病,在歷次疫情流行中發(fā)揮著重要的作用。選用一葉抗流感膠囊防治甲型H1N1流感,FM1毒株感染小鼠3個(gè)劑量組的死亡數(shù)均有一定程度的降低,高、中劑量組均能明顯延長(zhǎng)感染小鼠的存活天數(shù),與模型對(duì)照組比較具有顯著性差異。PR8感染小鼠3個(gè)劑量組預(yù)防給藥動(dòng)物的死亡數(shù)、存活天數(shù)沒(méi)有明顯變化,FM1、PR8感染一葉抗流感膠囊預(yù)防組的肺指數(shù)均沒(méi)有明顯改變。CPE法通過(guò)觀察一葉抗流感膠囊對(duì)甲型H1N1流感病毒FM1,PR8感染MDCK細(xì)胞的病變